タンパク質-タンパク質相互作用や DNA 損傷速度論を研究する共焦点の顕微鏡検査の技術を高度な
Summary
レーザー microirradiation は、細胞の DNA 修復の研究のための便利なツールです。様々 な DNA 損傷を誘発する UVA レーザーの使用のための方法論的アプローチが表示されます。正常な細胞周期; を維持するローカルの microirradiation のメソッドを最適化します。したがって、照射された細胞は有糸分裂を続行します。
Abstract
レーザーでローカル microirradiation は、生きた細胞の DNA 修復関連プロセスの研究のための有用なツールを表します。ここでは、ローカル microirradiated クロマチンの時間または蛋白質蛋白質の相互作用の上で DNA 蛋白質の動力学を分析する方法論的アプローチについて述べる。また Fucci セルラ システムを使用して DNA の病変の細胞周期依存性蛋白質の動力学を研究する細胞周期の個々 の段階を認識する方法を示します。2 つの UV レーザーの使用の方法論的説明 (355 nm、405 nm) また提示異なるタイプの DNA 損傷を誘発します。405 nm 半導体レーザによる細胞 microirradiated のみ通常の有糸分裂を通って進んで行くとシクロブタン ピリミジン二量体 (チミン) を欠いています。また興味の内因性の蛋白質のバイオアセッテイを実行する指定された時点での microirradiated セルの修正方法を示します。DNA 修復研究には自発的に発生すると細胞内 FRAP (退色後蛍光回復)、FLIM (蛍光寿命イメージング顕微鏡) を含む生物物理方法の使用を記述するさらに DNA 損傷病巣。タンパク質間相互作用の実験的研究の FLIM フレット (蛍光共鳴エネルギー移動) のアプリケーションを表示します。
Introduction
シクロブタン ピリミジン ダイマー (チミン)、8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine と一本鎖の DNA 病変の出現につながる DNA 損傷または二重鎖切断1,2。Γ 線は高浸透の最高のエネルギーと放射線のフォーム、放射のこの源は放射線療法3に広く利用します。その一方で、紫外線を UV レーザー mimics 自然暴露によって引き起こされる DNA 損傷が実験。UVA microirradiation 顕微鏡法、個々 の細胞における DNA 損傷を研究するため実験的なツールを表します。Microirradiation は、染色体の地域4、5の組織を明らかにするために 40 年前の最初の時間に使われました。この手法は、共焦点顕微鏡の機能プロパティのどちらかまたは現代 nanoscopy の技術的な限界に大きく依存。DNA 損傷を誘発するには、細胞を 5′ ブロモデオキシウリジン (BrdU) またはヘキスト 33342 UV 照射前にプレハブプレートベーすることができます。Bártováら6前述 presensitization ステップ、最近我々 は細胞死やアポトーシスを避けるためにこの microirradiation 技術を最適化します。たとえば、(ヘキスト 33342 前) なし 405 nm の紫外線レーザーの使用は、シクロブタン ピリミジン二量体 (チミン) を犠牲にして 53BP1 正二重鎖切断 (Dsb) の誘導につながります。UV microirradiation と組み合わせる presensitization の手順、他の一方で、同時にチミンと Dsb の非常に高いレベルを誘発する7,8。この方法は、単一の DNA 修復経路の研究に適用することは困難です。
Microirradiation、蛋白質の募集、速度、および細胞内 DNA 損傷における相互作用を分析することが可能です。このメソッドの例が Luijsterburgらによって出版されました。ヘテロクロマチン蛋白質 1 β と私たちの9は最近紫外線による DNA 病変6,10多能性因子 Oct4 と coilin、カハール体に関連付けられている蛋白質を募集初めて示した。これらの DNA 損傷で蛋白質の動力学 FRAP (退色後蛍光回復)11,12,13を使用して学ぶことがまたは (蛍光共鳴エネルギー移動) 技術14 フレット ,15。これらのメソッドには、DNA 損傷または蛋白質蛋白質の相互作用の蛋白質の単純な拡散を明らかにする可能性があります。蛋白質のさらに特性評価のための便利なツールは、FLIM (蛍光寿命イメージング顕微鏡) やフレット技術 (フレット FLIM)16との組み合わせです。これらのメソッドは、一過性でタグ付けされた蛍光分子17興味の蛋白質を表現する安定細胞のプロセスの研究を有効にします。ここでは、GFP 付けられた p53 タンパク質と DNA 損傷応答18,19に重要な役割を果たして相互作用パートナー、mCherry タグ 53BP1 の指数関数的減衰時間 (τ) の例を示します。パラメーター τ FLIM 計算によって提供される螢光色素の寿命は、与えられた蛍光染料、そのバインド能力とその細胞環境の特定です。したがって、このメソッド私たちを見ること蛋白質の集団、その結合能力と機能特性の違い、たとえば、DNA 損傷の後。
ここでは、時間特定の蛋白質の募集、動態、拡散、および microirradiated クロマチンのサイトでタンパク質間相互作用を検討する私たちの研究室で使用されている高度の顕微鏡検査の技術の方法論的アプローチの概要表示されます。ローカル DNA 傷害、細胞の誘導とローカル誘発 DNA 損傷紫外線レーザーによって引き起こされる DNA 損傷関連イベントの研究方法論の説明のステップバイ ステップの方法論を提供しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
顕微鏡検査の技術は、研究室での基本的なツールを表します。ここでは、タンパク質募集の検討用の方法の簡単な説明と DNA 損傷で速度が表示されます。我々 は特に生きている細胞のローカル microirradiation の分野で我々 の実験的経験を指摘し、アクセプタ漂白フレット28による DNA 損傷とその高度な縛ると蛋白質-蛋白質の相互作用蛋白質の動力学の研究について論じるフレ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、プロジェクト P302 12 G157 チェコ共和国の助成金機構によって支えられました。実験はまたノルウェーの資金によって、文部省、青少年とチェコ共和国のスポーツによって監督されているチェコ語ノルウェー語研究プログラム CZ09 によって支えられた (許可番号: 7F14369)。
Materials
| Cell cultivation | |||
| HeLa | ATCC | CCL-2TM | |
| ES-D3 [D3] | ATCC | CRL-11632TM | |
| HeLa -Fucci cells | http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html | ||
| DMEM | PAN-Biotech | P03-0710 | |
| DMEM high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SV30180.03 | |
| ES Cell FBS | Gibco | 16141-079 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) | Merck Millipore | ESG1107 | |
| MTG (1-Thioglycerol) | Sigma-Aldrich | M6145-25ML | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biosera | XC-A4122/100 | |
| Trypsin – EDTA | Biosera | XC-T1717/100 | dilute with 1 × PBS in ratio 1:6 |
| Nunclon cell culture dishes | Sigma-Aldrich | P7866 | cultivation of mESCs D3 cells |
| µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 | Ibidi GmbH | 81166 | microscopic dish |
| 0.2% Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | dilute in destille water and autoclaved |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell transfection | |||
| GFP-p53 plasmid | Addgene | 12091 | |
| mCherry-PCNA plasmid | generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt | ||
| mCherry-53BP1 plasmid | Addgene | 19835 | |
| Metafecetene | Biontex Laboratories GmbH | T020–2.0 | |
| 10 × PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water |
| 5-bromo-2’-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | 11296736001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscopy | |||
| Microscope Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| White-light laser | Leica Microsystems | ||
| 355-nm laser | Coherent Inc. | laser power 80 mW | |
| 405-nm laser | Leica Microsystems | laser power 50 mW | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence staining | |||
| Coverslip | VWR International Ltd | 631-1580 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Triton X100 | MP Biomedicals | 2194854 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 53BP1 | Abcam | ab21083 | primary antibody |
| AlexaFluore 647 | Thermo Fisher Scientific | A27040 | secondary antibody |
| Vectashield | Vector Laboratories Ltd | H-1000 | mounting medium |
Riferimenti
- Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions. Photochem Photobiol. 88 (5), 1048-1065 (2012).
- Cooke, M. S., et al. Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair. J Immunol Methods. 280 (1-2), 125-133 (2003).
- Lahtz, C., et al. Gamma irradiation does not induce detectable changes in DNA methylation directly following exposure of human cells. PLoS One. 7 (9), e44858 (2012).
- Cremer, T., et al. Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84. Hum Genet. 74 (4), 346-352 (1986).
- Zorn, C., Cremer, T., Cremer, C., Zimmer, J. Laser UV microirradiation of interphase nuclei and post-treatment with caffeine. A new approach to establish the arrangement of interphase chromosomes. Hum Genet. 35 (1), 83-89 (1976).
- Bartova, E., et al. Recruitment of Oct4 protein to UV-damaged chromatin in embryonic stem cells. PLoS One. 6 (12), e27281 (2011).
- Stixova, L., et al. HP1beta-dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs. Epigenetics Chromatin. 7 (1), 39 (2014).
- Stixova, L., et al. Advanced microscopy techniques used for comparison of UVA- and gamma-irradiation-induced DNA damage in the cell nucleus and nucleolus. Folia Biol (Praha). 60, 76-84 (2014).
- Luijsterburg, M. S., et al. Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage. J Cell Biol. 185 (4), 577-586 (2009).
- Bartova, E., et al. Coilin is rapidly recruited to UVA-induced DNA lesions and gamma-radiation affects localized movement of Cajal bodies. Nucleus. 5 (3), 460-468 (2014).
- Franek, M., et al. Advanced Image Acquisition and Analytical Techniques for Studies of Living Cells and Tissue Sections. Microsc Microanal. 22 (2), 326-341 (2016).
- Lemmer, P., et al. Using conventional fluorescent markers for far-field fluorescence localization nanoscopy allows resolution in the 10-nm range. J Microsc. 235 (2), 163-171 (2009).
- Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nat Cell Biol. 3 (6), E145-E147 (2001).
- Lakowitz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
- Levitt, J. A., Matthews, D. R., Ameer-Beg, S. M., Suhling, K. Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology. Curr Opin Biotechnol. 20 (1), 28-36 (2009).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
- Iwabuchi, K., Bartel, P. L., Li, B., Marraccino, R., Fields, S. Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (13), 6098-6102 (1994).
- Ward, I. M., Minn, K., van Deursen, J., Chen, J. p53 Binding protein 53BP1 is required for DNA damage responses and tumor suppression in mice. Mol Cell Biol. 23 (7), 2556-2563 (2003).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr Biol. 8 (7), 377-385 (1998).
- Walter, J., Schermelleh, L., Cremer, M., Tashiro, S., Cremer, T. Chromosome order in HeLa cells changes during mitosis and early G1, but is stably maintained during subsequent interphase stages. J Cell Biol. 160 (5), 685-697 (2003).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Tracing the silhouette of individual cells in S/G2/M phases with fluorescence. Chem Biol. 15 (12), 1243-1248 (2008).
- Sorokin, D. V., et al. Localized movement and morphology of UBF1-positive nucleolar regions are changed by gamma-irradiation in G2 phase of the cell cycle. Nucleus. 6 (4), 301-313 (2015).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS One. 7 (11), e49593 (2012).
- Foltankova, V., Matula, P., Sorokin, D., Kozubek, S., Bartova, E. Hybrid detectors improved time-lapse confocal microscopy of PML and 53BP1 nuclear body colocalization in DNA lesions. Microsc Microanal. 19 (2), 360-369 (2013).
- Suchankova, J., et al. Distinct kinetics of DNA repair protein accumulation at DNA lesions and cell cycle-dependent formation of gammaH2AX- and NBS1-positive repair foci. Biol Cell. 107 (12), 440-454 (2015).
- Bártová, E., et al. PCNA is recruited to irradiated chromatin in late S phase and is most pronounced in G2 phase of the cell cycle. Protoplasma. , (2017).
- Krejci, J., et al. Post-Translational Modifications of Histones in Human Sperm. J Cell Biochem. 116 (10), 2195-2209 (2015).
- Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18475-18480 (2010).
- Sustackova, G., et al. Acetylation-dependent nuclear arrangement and recruitment of BMI1 protein to UV-damaged chromatin. J Cell Physiol. 227 (5), 1838-1850 (2012).
- Smirnov, E., et al. Separation of replication and transcription domains in nucleoli. J Struct Biol. 188 (3), 259-266 (2014).
- Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).
- Day, R. N. Measuring protein interactions using Forster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
- Konig, K., Uchugonova, A., Breunig, H. G. High-resolution multiphoton cryomicroscopy. Methods. 66 (2), 230-236 (2014).
