تعديل محطة الطرفية تقييد جزء تحليل لقياس طول تيلومير باستخدام التهجين في هلام
Summary
في هذه المقالة، ويناقش بروتوكول مفصل لقياس طول تيلومير باستخدام تعديل جزء طرفية تحليل جزء الذي يوفر قياسا سريعا وفعالا مباشرة من طول تيلومير. ويمكن تطبيق هذه التقنية على مجموعة متنوعة من مصادر الخلايا من الحمض النووي لقياس طول تيلومير.
Abstract
هناك العديد من التقنيات المختلفة لقياس طول التيلومير، ولكل منها مزاياها وعيوبها. يستخدم النهج التقليدي، تحليل تيلومير تقييد جزء (ترف)، تقنية التهجين الحمض النووي حيث يتم هضم عينات الحمض النووي الجيني مع الانزيمات تقييد، وترك وراءها تيلومير الحمض النووي يكرر وبعض الحمض النووي تيلوميري الفرعية. يتم فصل هذه عن طريق الكهربائي الاغاروز هلام، ونقلها إلى غشاء فلتر وهجين إلى تحقيقات قليل النوكليوتيد الموسومة مع إما التوهج أو النشاط الإشعاعي لتصور شظايا تقييد تيلومير. هذا النهج، في حين تتطلب كمية أكبر من الحمض النووي من التقنيات الأخرى مثل ير، يمكن قياس توزيع طول تيلومير من السكان من الخلايا ويسمح قياس أعرب في كيلوباسس المطلقة. توضح هذه المخطوطة إجراء تهجين الحمض النووي المعدل لتحديد طول تيلومير. يتم هضم الحمض النووي الجيني لأول مرة مع الانزيمات تقييد (التي لا قطعالتيلوميرات) وفصلها الكهربائي الاغاروز هلام. ثم يتم تجفيف الجل والحمض النووي هو التشويه والتحريف في الموقع إلى التحقيق أوليغونكلأوتيد راديولبلد. هذا التهجين في الموقع يتجنب فقدان الحمض النووي تيلومير ويحسن كثافة الإشارة. بعد التهجين، يتم تصوير المواد الهلامية باستخدام شاشات الفوسفور ويتم قياس طول تيلومير باستخدام برنامج الرسوم البيانية. وقد تم تطوير هذا الإجراء من قبل مختبرات الدكاترة. وودرينغ رايت وجيري شي في جامعة تكساس جنوب غرب 1 ، 2 . هنا، نقدم وصفا مفصلا لهذا الإجراء، مع بعض التعديلات.
Introduction
تيلوميرس، وتقع في نهايات الكروموسومات، وتكرر النيوكليوتيدات من تسلسل تغغ (على الكروموسومات البشرية) التي تلعب دورا حاسما في حماية المعلومات الوراثية الخلوية 3 ، 4 ، 5 . التيلوميرات هي عدة آلاف من أزواج قاعدة في الطول وتعمل على حماية سلامة بقية الكروموسوم خلال تكرار الحمض النووي. النسخ المتماثل من الكروموسومات ليست مثالية مما أدى إلى الغايات من الكروموسوم لا يتم نسخ تماما. ويسمى هذا عدم الكفاءة في تكرار "مشكلة تكرار نهاية" ويؤدي إلى فقدان بعض تيلومير يكرر خلال كل جولة من النسخ المتماثل 6 ، 7 . يمكن استعادة طول تيلومير بعد انقسام الخلايا عن طريق تيلوميراز، وهو انزيم الذي يحل محل تسلسل تيلومير المفقودة 8 ، 9 . ومع ذلك، التيلوميراز ليس كذلكتنشيطها في معظم الخلايا الجسدية البشرية ونتيجة لذلك، مع مرور الوقت، سوف تلوميرس تقصير، مما أدى في النهاية إلى الشيخوخة الخلوية 10 . نظرا لتقصير التيلومير، تعتبر التيلوميرات علامة بيولوجية للشيخوخة وخطر الأمراض المرتبطة بالعمر 11 ، 12 . بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تتأثر طول تيلومير من العوامل الوراثية والبيئية، ونمط الحياة وغيرها من المحفزات مثل الإجهاد التأكسدي، مشيرا إلى أن طول تيلومير يمكن أن تلعب دورا كعلامة بيولوجية في الدراسات السمية والوبائية والسلوكية 13 ، 14 ، 15 .
توضح هذه المقالة تقنية لقياس طول التيلومير باستخدام تحليل مقطعي طرفية مقسم (ترف) تم تكييفه من مندر وشاي 2 وكيمورا وآخرون. 16 ، ومثل هربرت، شاي والريغهت 1 و هوسمان و موك 17 . تقليديا، تحليل ترف ينطوي على إجراء لطخة الجنوبية. وتعتبر البقع الجنوبية "معيار الذهب" لدراسة طول تيلومير وتستخدم بنشاط لدراسة طول الكريات البيض في دراسات علم الأوبئة 18 . يستخدم هذا التحليل ترف هضم الحمض النووي الجيني ترك وراء تيلومير يكرر. ثم يتم فصل شظايا الحمض النووي عن طريق الرحلان الكهربائي، والتشويه والتحويل إلى غشاء النيتروسليلوز. يتم تهجين متواليات التيلومير إلى مسبار قليل النوكليوتيد تيلومير. بدلا من نقل التيلوميرات فصل إلى غشاء، تقنيات ترف أخرى تستخدم في التهجين هلام تقنيات مع وبدون تمسخ الحمض النووي. إن إدراج التشوه مهم عند النظر في الكشف عن التيلوميرات الخلالية، التي تم الإبلاغ عنها في بعض الأنواع 19 . الإجراءات التي تفتقر إلى تغيير طبيعة الخطوات فقط كشف ثه واحد تقطعت بهم السبل الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل في تلوميرس الطرفية ولن ربط تسلسل تيلومير الخلالي 18 .
إلى جانب تحليل ترف، وهناك العديد من التقنيات الأخرى لقياس طول تيلومير أن لكل منها مزاياها وعيوبها. تقنية تدفق فيش يمكن قياس متوسط طول تيلومير من الخلايا الفردية من نوع خلية متميزة باستخدام التدفق الخلوي 16 ، 20 . في حين أنه يمكن أن علامة بدقة التيلوميرات مع تحقيقات محددة للغاية وتقليل الخطأ البشري من خلال الأتمتة، تدفق الأسماك هي مكلفة وأقل كفاءة ويتطلب عينات جديدة وفني ذو مهارات عالية، مما يحد من قدرتها على دراسات علم الأوبئة 16 . وبالإضافة إلى ذلك، هذه الطريقة لا تمثل التغيرات المحتملة في عدد الكروموسومات في عدد السكان الخلية. تقنية أخرى، قر، مقبولة على نطاق واسع كوسيلة لقياس طول تيلومير لدراسات علم الأوبئة <sup كلاس = "كريف"> 16 بسبب إنتاجية عالية، منخفضة التكلفة ومتطلبات كميات صغيرة من الحمض النووي مقارنة مع أساليب أخرى. ومع ذلك، قر يمكن فقط قياس متوسط محتوى الحمض النووي تيلوميريك نسبة إلى الجين نسخة واحدة، وبالتالي، تقدير غير مباشر لمتوسط طول التيلومير. كما أنها تعطي معامل عال من التباين في دراسات المقارنة، مقارنة مع البقع الجنوبية، مما يؤدي إلى دقة مشكوك فيها 21 .
الإجراء ترف له أوجه القصور الخاصة التي تحد من استخدامه لبعض الدراسات. تقنيات ترف تتطلب كمية كبيرة من الحمض النووي مقارنة مع أساليب أخرى (بين 2 و 3 ميكروغرام لكل عينة). وهذا يحد من تطبيقات التقنية لفحص طول تيلومير من العينات السريرية التي يمكن جمع الحمض النووي الجيني كافية، ولا يمكن استخدامها على عينات الحمض النووي المتدهورة. بالإضافة إلى ذلك، فإن تحليل ترف مكلف وكثيفة العمالة، والتي تتطلب 4-5 أيام لتحقيق نتائج. ومع ذلك، فإن ترف ينتج معامل انخفاض التباينمنح استنساخه. في حين أن هذا البروتوكول هو مختلف عن لطخة الجنوبية التقليدية (الاستفادة في الموقع التهجين هلام)، وتقنيات اثنين هي في الأساس نفسه.
التقنية المعروضة هنا هي مزيج من لطخة الجنوبية وهجن في التهجين. ربط خطوة تغيير طبيعة الحمض النووي من البقع الجنوبية مع التهجين في هلام. هذا الجمع لديه فائدة إضافية من تحسين قوة إشارة التحقيق مقارنة مع لطخة الجنوبية، وقد أسفرت باستمرار نتائج قابلة للقياس داخل مختبرنا. بالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام تحقيقات المشعة بدلا من تحقيقات تشيميلومينسنت يعطي كثافة إشارة أعلى ويسمح للتصور والتقدير الكمي مع فوسفهوريماجر، مما يجعل تحليلات ترف سهل الاستعمال.
Protocol
Representative Results
Discussion
بعد الكهربائي، تشويه الحمض النووي الجيني أعلى من 800 بي بي. يمكن أن يحدث هذا إذا كانت إنزيمات التقييد خاطئة أو إذا كانت هناك حاجة لإنزيمات إضافية (كما هو موضح أعلاه). وهناك تفسير آخر محتمل هو أن البروتين لا يزال تعلق على الحمض النووي. عند تحديد تركيز الحمض النووي من قبل ا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب تعترف بدعم من معهد جامعة بيتسبرغ للسرطان بيوبهافيورال الأورام مرفق مشترك التي يتم دعمها جزئيا من قبل جائزة P30CA047904.
Materials
| Biologics | |||
| Rsa1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0167S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Hinf1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0155S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | electrophoresis grade agarose |
| Optikinase | affymetrix | 78334X 500 UN | T4 Polynucleotide Kinase |
| SYBR Green Nucleic Acid Stain I | ThermoFisher Scientific | S7567 | Syber Green |
| exactGene DNA Ladder 24- kB | Fisher Scientific | BP2580100 | |
| C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5) | Integrated DNA Technologies | Custom ordered DNA oligonucleotide | |
| Gamma-ATP-P32 | Perkin Elmer | BLU502Z | Radioisotope |
| Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit | Qiagen | 13323 | DNA extraction kit |
| GE Illustra Microspin G-25 column | GE Healthcare Life Sciences | 27-5325-01 | For purification of readioactive oligo probe |
| Ficoll 400 | non-ionic synthetic polymer | ||
| Equipment/Software | |||
| Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm) | ThermoFisher Scientific | A5 | Gel electrophoresis |
| Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm) | Corel Life Sciences | 11068020 | Gel electrophoresis |
| Nylon mesh, 50, 12" x 12" | Ted Pellam, Inc | 41-12105 | |
| GE Storage Phosphor Screens | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-75 | |
| Phosphor Screen Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | 63-0035-44 | |
| Isotemp Hybridzation Incubator | Fisher Scientific | 13-247-20Q | |
| Cylindrical hybridization tubes | Fisher Scientific | 13-247-300 | |
| The Belly Dancer orbital shaker | Sigma-aldrich | Z768499-1EA | Orbital shaker |
| Typhoon 9400 | ABI | For imaging of gels and phosphor screens | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad | Version 6.05 | Graphing Program |
| Microsoft Excel | Microsoft | Office 365 | Spreadsheet program |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrp 2000 | Spectrophotometer |
Riferimenti
- Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. Analysis of telomeres and telomerase. Curr Protoc Cell Biol. , 16 (2003).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis. Bio Protoc. 5 (22), (2015).
- Blackburn, E. H. Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).
- Greider, C. W. Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).
- Szostak, J. W. DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).
- Watson, J. M., Riha, K. Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah – A Mini-Review. Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).
- Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M. Telomeres-Structure, Function, and Regulation. Exp Cell Res. 319 (2), 133-141 (2013).
- MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. Telomerase Regulation from Beginning to the End. Genes (Basel). 7 (9), 64 (2016).
- Fouquerel, E., Opresko, P. Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair. Photochem Photobiol. , (2016).
- Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence. Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).
- Opresko, P. L., Shay, J. W. Telomere-Associated Aging Disorders. Ageing Res Rev. , 1568-1637 (2016).
- Chiodi, I., Mondello, C. Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).
- Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
- Lindqvist, D., et al. Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging. Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).
- Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M. Telomeres in Molecular Epidemiology Studies. Prog Mol Biol Transl Sci. 125 (113), (2014).
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Haussmann, M. F., Mauck, R. A. TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation. Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).
- Nussey, D. H., et al. Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology. Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).
- Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening. Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).
- Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH). Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).
- Sanders, J. L., Newman, A. B. Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither. Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).
- Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts. Nat Commun. 6, 8214 (2015).
