Analyse modifiée des fragments de restriction des terminaux pour quantifier la longueur de télomère à l'aide de l'hybridation en gel
Summary
Dans cet article, un protocole détaillé pour quantifier la longueur des télomères en utilisant une analyse de fragment de restriction terminale modifiée est discuté qui fournit une mesure directe rapide et efficace de la longueur des télomères. Cette technique peut être appliquée à une variété de sources cellulaires d'ADN pour quantifier la longueur des télomères.
Abstract
Il existe plusieurs techniques différentes pour mesurer la longueur des télomères, chacune avec leurs propres avantages et inconvénients. L'approche traditionnelle, l'analyse du fragment de restriction Telomere (TRF), utilise une technique d'hybridation d'ADN dans laquelle les échantillons d'ADN génomique sont digérés avec des enzymes de restriction, laissant derrière eux des répétitions d'ADN de télomères et un certain ADN sous-télomérique. Ceux-ci sont séparés par une électrophorèse sur gel d'agarose, transférés dans une membrane filtrante et hybridés à des sondes oligonucléotidiques marquées avec chimioluminescence ou radioactivité pour visualiser des fragments de restriction telomère. Cette approche, tout en nécessitant une plus grande quantité d'ADN que d'autres techniques telles que la PCR, peut mesurer la répartition de la longueur des télomères d'une population de cellules et permet une mesure exprimée en kilobases absolues. Ce manuscrit démontre une procédure d'hybridation d'ADN modifiée pour déterminer la longueur des télomères. L'ADN génomique est d'abord digéré avec des enzymes de restriction (qui ne coupent pasTélomères) et séparés par électrophorèse sur gel d'agarose. Le gel est ensuite séché et l'ADN est dénaturé et hybride in situ à une sonde oligonucléotidique radiomarquée. Cette hybridation di situ évite la perte d'ADN des télomères et améliore l'intensité du signal. Après l'hybridation, les gels sont imagés à l'aide d'écrans phosphores et la longueur des télomères est quantifiée à l'aide d'un programme graphique. Cette procédure a été développée par les laboratoires des Drs. Woodring Wright et Jerry Shay à l'Université du Texas Southwestern 1 , 2 . Ici, nous présentons une description détaillée de cette procédure, avec quelques modifications.
Introduction
Les télomères, situés aux extrémités des chromosomes, sont des répétitions nucléotidiques de la séquence TTAGGG (sur les chromosomes humains) qui jouent un rôle essentiel dans la protection de l'information génétique cellulaire 3 , 4 , 5 . Les télomères ont plusieurs milliers de paires de bases et servent à protéger l'intégrité du reste du chromosome pendant la réplication de l'ADN. La réplication des chromosomes n'est pas parfaite, de sorte que les extrémités du chromosome ne sont pas complètement copiées. Cette inefficacité dans la réplication est appelée «problème de réplication de fin» et entraîne la perte de certaines des répétitions de télomères au cours de chaque cycle de réplication 6 , 7 . La longueur de la télomère peut être restaurée après la division cellulaire par la télomérase, une enzyme qui remplace les séquences des télomères perdus 8 , 9 . La télomérase, cependant, n'est pasActivé dans la plupart des cellules somatiques humaines et, par conséquent, au fil du temps, les télomères se raccourciront, entraînant éventuellement une sénescence cellulaire 10 . En raison du raccourcissement des télomères, les télomères sont considérés comme un biomarqueur du vieillissement et le risque de maladies liées à l'âge 11 , 12 . En outre, la longueur des télomères peut être affectée par des facteurs génétiques, environnementaux et de style de vie et d'autres stimuli tels que le stress oxydatif, ce qui indique que la longueur des télomères peut jouer un rôle de biomarqueur dans les études toxicologiques, épidémiologiques et comportementales 13 , 14 , 15 .
Cet article démontre une technique de mesure de la longueur des télomères en utilisant une analyse de fragment de restriction terminale modifiée (TRF) adaptée de Mender et Shay 2 et Kimura et al. 16 , et similaire à Herbert, Shay et WrigHt 1 et Haussmann et Mauck 17 . Traditionnellement, l'analyse des TRF implique une procédure Southern Blot. Les transferts de Southern sont considérés comme «l'étalon de l'or» pour étudier la longueur des télomères et sont activement utilisés pour examiner la longueur des télomères leucocytaires dans les études épidémiologiques 18 . Cette analyse TRF utilise l'ADN génomique digéré en laissant les répétitions des télomères. Les fragments d'ADN sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel, dénaturés et transférés sur une membrane de nitrocellulose. Les séquences de télomères sont hybridées avec une sonde d'oligonucléotide télomère. Plutôt que de transférer les télomères séparés sur une membrane, d'autres techniques de TRF utilisent des techniques d'hybridation en gel avec et sans dénaturation de l'ADN. L'inclusion de la dénaturation est importante lorsque l'on considère la détection des télomères interstitiels, qui ont été signalés dans certaines espèces 19 . Les procédures qui ne comportent pas les étapes de dénaturationLes rayons d'ADN monocaténaires sur les télomères terminaux et ne se lient pas aux séquences interstitielles des télomères 18 .
Outre l'analyse TRF, il existe plusieurs autres techniques de mesure de la longueur des télomères qui ont chacun leurs propres avantages et inconvénients. La technique Flow-FISH peut mesurer la longueur moyenne des télomères de cellules individuelles d'un type cellulaire distinct en utilisant la cytométrie en flux 16 , 20 . Bien qu'il puisse étiqueter avec précision des télomères avec des sondes hautement spécifiques et réduire les erreurs humaines par l'automatisation, Flow-FISH est coûteux, moins efficace et nécessite des échantillons frais et un technicien hautement qualifié, ce qui limite sa capacité à des études épidémiologiques 16 . En outre, cette méthode ne tient pas compte des changements potentiels dans le nombre de chromosomes dans la population cellulaire. Une autre technique, qPCR, est largement acceptée comme moyen de mesure de la longueur des télomères pour les études épidémiologiques <suP class = "xref"> 16 en raison de son débit élevé, son coût réduit et son exigence pour de petites quantités d'ADN par rapport à d'autres méthodes. Cependant, qPCR ne peut mesurer que le contenu d'ADN telomérique moyen par rapport à un gène de copie unique et est donc une estimation indirecte de la longueur moyenne des télomères. Il fournit également un coefficient de variance élevé dans les études de comparaison, par rapport aux transferts du sud, ce qui entraîne une précision douteuse 21 .
La procédure TRF a ses propres lacunes qui limitent son utilisation pour certaines études. Les techniques TRF nécessitent une grande quantité d'ADN par rapport à d'autres méthodes (entre 2 et 3 μg par échantillon). Cela limite les applications de la technique à l'examen de la longueur des échantillons cliniques des télomères pour lesquels un ADN génomique suffisant peut être collecté et ne peut être utilisé sur des échantillons d'ADN dégradés. De plus, l'analyse des TRF est coûteuse et nécessite beaucoup de main-d'œuvre, nécessitant 4 à 5 jours pour produire des résultats. Cependant, le TRF donne un faible coefficient de varianceEn accordant sa reproductibilité. Alors que ce protocole est différent de l'échappement Southern traditionnel (utilisant une hybridation sur gel di situ), les deux techniques sont fondamentalement les mêmes.
La technique présentée ici est une combinaison d'un transfert de Southern et d'une hybridation en gel; Associant l'étape de dénaturation d'ADN des transferts de Southern avec l'hybridation en gel. Cette combinaison a le bénéfice supplémentaire de la puissance du signal de sonde améliorée par rapport au transfert de Southern et a consisté à produire des résultats quantifiables dans notre laboratoire. En outre, l'utilisation de sondes radioactives plutôt que de sondes chimioluminescentes donne une intensité de signal plus élevée et permet la visualisation et la quantification avec un agent de phosphorimagerie, ce qui rend les analyses du TRF faciles à utiliser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Après électrophorèse, le frottis d'ADN génomique est supérieur à 800 pb. Cela peut se produire si les enzymes de restriction sont défectueuses ou si des enzymes supplémentaires (comme décrit ci-dessus) sont nécessaires. Une deuxième explication possible est que la protéine est toujours attachée à l'ADN. Lors de la détermination de la concentration d'ADN par spectrophotomètre, le ratio 260/280 devrait être d'environ 1,8. Si ce rapport est <1,5, il existe une contamination des protéine…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent le soutien de l'installation partagée de l'Université de Pittsburgh Cancer Institute Biobehavioral Oncology, soutenue en partie par le prix P30CA047904.
Materials
| Biologics | |||
| Rsa1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0167S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Hinf1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0155S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | electrophoresis grade agarose |
| Optikinase | affymetrix | 78334X 500 UN | T4 Polynucleotide Kinase |
| SYBR Green Nucleic Acid Stain I | ThermoFisher Scientific | S7567 | Syber Green |
| exactGene DNA Ladder 24- kB | Fisher Scientific | BP2580100 | |
| C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5) | Integrated DNA Technologies | Custom ordered DNA oligonucleotide | |
| Gamma-ATP-P32 | Perkin Elmer | BLU502Z | Radioisotope |
| Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit | Qiagen | 13323 | DNA extraction kit |
| GE Illustra Microspin G-25 column | GE Healthcare Life Sciences | 27-5325-01 | For purification of readioactive oligo probe |
| Ficoll 400 | non-ionic synthetic polymer | ||
| Equipment/Software | |||
| Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm) | ThermoFisher Scientific | A5 | Gel electrophoresis |
| Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm) | Corel Life Sciences | 11068020 | Gel electrophoresis |
| Nylon mesh, 50, 12" x 12" | Ted Pellam, Inc | 41-12105 | |
| GE Storage Phosphor Screens | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-75 | |
| Phosphor Screen Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | 63-0035-44 | |
| Isotemp Hybridzation Incubator | Fisher Scientific | 13-247-20Q | |
| Cylindrical hybridization tubes | Fisher Scientific | 13-247-300 | |
| The Belly Dancer orbital shaker | Sigma-aldrich | Z768499-1EA | Orbital shaker |
| Typhoon 9400 | ABI | For imaging of gels and phosphor screens | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad | Version 6.05 | Graphing Program |
| Microsoft Excel | Microsoft | Office 365 | Spreadsheet program |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrp 2000 | Spectrophotometer |
Riferimenti
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