Aangepaste Terminal Restriction Fragment Analyse voor het kwantificeren van telomere lengte met behulp van in-gel hybridisatie
Summary
In dit artikel wordt een gedetailleerd protocol voor het kwantificeren van telomere lengte met behulp van een gewijzigde terminal restrictie fragment analyse besproken die snelle en efficiënte directe meting van telomere lengte biedt. Deze techniek kan toegepast worden op een verscheidenheid aan celbronnen van DNA voor het kwantificeren van telomere lengte.
Abstract
Er zijn verschillende technieken voor het meten van telomere lengte, elk met hun eigen voor- en nadelen. De traditionele benadering, Telomere Restriction Fragment (TRF) analyse, maakt gebruik van een DNA hybridisatie techniek waarbij genomische DNA monsters worden verteerd met restrictie enzymen, waardoor telomere DNA repeats achtergelaten en wat sub-telomeer DNA. Deze worden gescheiden door agarosegelelektroforese, overgebracht naar een filtermembraan en gehybridiseerd aan oligonucleotide probes gemarkeerd met ofwel chemiluminescentie of radioactiviteit om telomere restrictiefragmenten te visualiseren. Deze aanpak, terwijl een grotere hoeveelheid DNA nodig is dan andere technieken, zoals PCR, kan de telomere lengteverdeling van een populatie cellen meten en de meting uitgedrukt in absolute kilobasen kunnen meten. Dit manuscript demonstreert een gemodificeerde DNA hybridisatie procedure voor het bepalen van telomere lengte. Genomisch DNA wordt eerst verteerd met restrictie-enzymen (die niet knippenTelomeren) en gescheiden door agarosegel-elektroforese. De gel wordt vervolgens gedroogd en het DNA wordt gedenatureerd en in situ gehybridiseerd aan een radioactief gemerkte oligonucleotide probe. Deze in situ hybridisatie vermijdt verlies van telomere DNA en verbetert de signaalintensiteit. Na hybridisatie worden de gels afgebeeld met behulp van fosforschermen en de telomere lengte wordt gekwantificeerd met behulp van een grafisch programma. Deze procedure is ontwikkeld door de laboratoria van Drs. Woodring Wright en Jerry Shay aan de Universiteit van Texas Southwestern 1 , 2 . Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving van deze procedure, met enkele wijzigingen.
Introduction
Telomeren, gelegen aan de uiteinden van chromosomen, zijn nucleotide repeats van de sequentie TTAGGG (op menselijke chromosomen) die een cruciale rol spelen bij het beschermen van cellulaire genetische informatie 3 , 4 , 5 . Telomeren zijn enkele duizend basisparen in lengte en dienen om de integriteit van de rest van het chromosoom tijdens DNA-replicatie te beschermen. Replicatie van chromosomen is niet perfect, waardoor de uiteinden van het chromosoom niet volledig worden gekopieerd. Deze inefficiëntie in replicatie heet het "eind replicatie probleem" en resulteert in het verlies van enkele telomere repeats tijdens elke ronde replicatie 6 , 7 . Telomere lengte kan worden hersteld na celverdeling door telomerase, een enzym dat de verloren telomere sequenties 8 , 9 vervangt. Telomerase is echter nietGeactiveerd in de meeste menselijke somatische cellen en als gevolg daarvan zullen telomeren mettertijd verkorten, uiteindelijk resulterend in cellulaire senescentie 10 . Door telomere verkorting worden telomeren beschouwd als een biomarker van veroudering en risico op leeftijd gerelateerde aandoeningen 11 , 12 . Daarnaast kan telomere lengte beïnvloed worden door genetische, milieu- en levensstijl factoren en andere stimuli zoals oxidatieve stress, wat aangeeft dat telomere lengte een rol kan spelen als biomarker in toxicologische, epidemiologische en gedragsstudies 13 , 14 , 15 .
Dit artikel toont een techniek voor het meten van telomere lengte door gebruik te maken van een gewijzigde terminale restrictie fragment (TRF) analyse aangepast van Mender and Shay 2 en Kimura et al. 16 , en vergelijkbaar met Herbert, Shay en WrigHt 1 en Haussmann en Mauck 17 . Traditioneel omvat TRF analyse een Southern blot procedure. Southern blots worden beschouwd als de "gouden standaard" voor het bestuderen van telomere lengte en worden actief gebruikt voor het onderzoeken van leukocyten telomere lengte in epidemiologie studies 18 . Deze TRF analyse maakt gebruik van gedigereerd genomisch DNA achter de telomere herhalingen. De DNA-fragmenten worden dan gescheiden door gelelektroforese, gedenatureerd en overgebracht naar een nitrocellulosemembraan. De telomere sequenties worden gehybridiseerd aan een telomere oligonucleotide probe. In plaats van de gescheiden telomeren naar een membraan over te brengen, gebruiken andere TRF-technieken in-gel hybridisatie technieken met en zonder denaturatie van het DNA. De opname van denaturatie is belangrijk bij het onderzoek naar de detectie van interstitiële telomeren, die bij sommige soorten 19 zijn gerapporteerd. Procedures die geen denaturerende stappen hebben, detecteren alleen thE enkelstrengige DNA overhangen bij terminale telomeren en bindt niet aan interstitiële telomere sequenties 18 .
Naast TRF analyse zijn er verschillende andere technieken om telomere lengte te meten die elk hun eigen voor- en nadelen hebben. De Flow-FISH-techniek kan de gemiddelde telomere lengte van individuele cellen van een duidelijk celtype meten met behulp van flowcytometrie 16 , 20 meten. Hoewel het telomeren met zeer specifieke probes nauwkeurig kan taggen en de menselijke fout door automatisering kan verminderen, is Flow-FISH duur, minder efficiënt en vereist verse monsters en een hooggeschoolde technicus, waardoor zijn capaciteit voor epidemiologische studies beperkt is 16 . Bovendien geeft deze methode geen rekening met mogelijke veranderingen in het aantal chromosomen in de celpopulatie. Een andere techniek, qPCR, wordt algemeen geaccepteerd als middel om telomere lengte te meten voor epidemiologische studies <suP class = "xref"> 16 door zijn hoge doorvoer, lage kosten en vereiste voor kleine hoeveelheden DNA in vergelijking met andere methoden. Echter, qPCR kan alleen gemiddeld telomeer DNA-gehalte meten aan een enkelkopie gen en is dus een indirecte schatting van de gemiddelde telomere lengte. Het geeft ook een hoge variatiecoëfficiënt in vergelijkende studies, vergeleken met zuidelijke blots, wat leidt tot twijfelachtige nauwkeurigheid 21 .
De TRF procedure heeft zijn eigen tekortkomingen die het gebruik ervan beperken voor sommige studies. TRF technieken vereisen een grote hoeveelheid DNA in vergelijking met andere methoden (tussen 2 en 3 μg per monster). Dit beperkt de toepassingen van de techniek om de telomere lengte van klinische monsters te onderzoeken waarvoor voldoende genomisch DNA kan worden verzameld en kan niet worden gebruikt op gedegradeerde DNA-monsters. Bovendien is de TRF-analyse kostbaar en arbeidsintensief, waarbij 4-5 dagen nodig zijn om resultaten op te leveren. De TRF levert echter een lage coëfficiënt van variantieDe reproduceerbaarheid ervan toestaan. Hoewel dit protocol anders is dan de traditionele Southern blot (gebruikmakend van in situ gel hybridisatie), zijn de twee technieken fundamenteel hetzelfde.
De hier gepresenteerde techniek is een combinatie van een Southern blot en in-gel hybridisatie; Associëren van de DNA-denatureringsstap van zuidelijke blots met de in-gel hybridisatie. Deze combinatie heeft het bijkomende voordeel van verbeterde sonde-signaalsterkte ten opzichte van de Southern blot en heeft consequent kwantificeerbare resultaten in ons lab verkregen. Bovendien levert het gebruik van radioactieve probes in plaats van chemiluminescerende probes een hogere signaalintensiteit en zorgt voor visualisatie en kwantificering met een fosforimager, waardoor de analyses van de gebruikersvriendelijke TRF worden gemaakt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Na elektroforese is het genomische DNA-smear hoger dan 800 bp. Dit kan optreden als de restrictie-enzymen defect zijn of indien extra enzymen (zoals hierboven beschreven) nodig zijn. Een tweede mogelijke verklaring is dat het eiwit nog steeds aan het DNA gehecht is. Bij het bepalen van de DNA-concentratie door spectrofotometer moet de 260/280 verhouding ongeveer 1,8 zijn. Als deze verhouding <1,5 bedraagt, is er eiwitverontreiniging die de restrictie-enzymvertering kan bemoeien. Ofwel zou het DNA-monster opnieuw geï…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen de steun van de Universiteit van Pittsburgh Cancer Institute Biobehavioral Oncology gedeelde faciliteit die gedeeltelijk wordt ondersteund door award P30CA047904.
Materials
| Biologics | |||
| Rsa1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0167S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Hinf1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0155S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | electrophoresis grade agarose |
| Optikinase | affymetrix | 78334X 500 UN | T4 Polynucleotide Kinase |
| SYBR Green Nucleic Acid Stain I | ThermoFisher Scientific | S7567 | Syber Green |
| exactGene DNA Ladder 24- kB | Fisher Scientific | BP2580100 | |
| C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5) | Integrated DNA Technologies | Custom ordered DNA oligonucleotide | |
| Gamma-ATP-P32 | Perkin Elmer | BLU502Z | Radioisotope |
| Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit | Qiagen | 13323 | DNA extraction kit |
| GE Illustra Microspin G-25 column | GE Healthcare Life Sciences | 27-5325-01 | For purification of readioactive oligo probe |
| Ficoll 400 | non-ionic synthetic polymer | ||
| Equipment/Software | |||
| Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm) | ThermoFisher Scientific | A5 | Gel electrophoresis |
| Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm) | Corel Life Sciences | 11068020 | Gel electrophoresis |
| Nylon mesh, 50, 12" x 12" | Ted Pellam, Inc | 41-12105 | |
| GE Storage Phosphor Screens | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-75 | |
| Phosphor Screen Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | 63-0035-44 | |
| Isotemp Hybridzation Incubator | Fisher Scientific | 13-247-20Q | |
| Cylindrical hybridization tubes | Fisher Scientific | 13-247-300 | |
| The Belly Dancer orbital shaker | Sigma-aldrich | Z768499-1EA | Orbital shaker |
| Typhoon 9400 | ABI | For imaging of gels and phosphor screens | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad | Version 6.05 | Graphing Program |
| Microsoft Excel | Microsoft | Office 365 | Spreadsheet program |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrp 2000 | Spectrophotometer |
Riferimenti
- Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. Analysis of telomeres and telomerase. Curr Protoc Cell Biol. , 16 (2003).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis. Bio Protoc. 5 (22), (2015).
- Blackburn, E. H. Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).
- Greider, C. W. Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).
- Szostak, J. W. DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).
- Watson, J. M., Riha, K. Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah – A Mini-Review. Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).
- Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M. Telomeres-Structure, Function, and Regulation. Exp Cell Res. 319 (2), 133-141 (2013).
- MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. Telomerase Regulation from Beginning to the End. Genes (Basel). 7 (9), 64 (2016).
- Fouquerel, E., Opresko, P. Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair. Photochem Photobiol. , (2016).
- Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence. Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).
- Opresko, P. L., Shay, J. W. Telomere-Associated Aging Disorders. Ageing Res Rev. , 1568-1637 (2016).
- Chiodi, I., Mondello, C. Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).
- Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
- Lindqvist, D., et al. Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging. Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).
- Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M. Telomeres in Molecular Epidemiology Studies. Prog Mol Biol Transl Sci. 125 (113), (2014).
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Haussmann, M. F., Mauck, R. A. TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation. Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).
- Nussey, D. H., et al. Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology. Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).
- Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening. Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).
- Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH). Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).
- Sanders, J. L., Newman, A. B. Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither. Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).
- Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts. Nat Commun. 6, 8214 (2015).
