Analisi di frammento di restrizione terminale modificata per quantificare la lunghezza di telomere utilizzando l'ibridazione in gel
Summary
In questo articolo viene descritto un protocollo dettagliato per quantificare la lunghezza del telomere utilizzando un'analisi del frammento di restrizione terminale modificata che fornisce una misurazione diretta veloce ed efficiente della lunghezza del telomere. Questa tecnica può essere applicata a una varietà di fonti cellulari di DNA per quantificare la lunghezza del telomere.
Abstract
Ci sono diverse tecniche per misurare la lunghezza del telomere, ciascuno con i propri vantaggi e svantaggi. L'approccio tradizionale, l'analisi del frammento di restrizione di Telomere (TRF), utilizza una tecnica di ibridazione del DNA in cui i campioni di DNA genomici vengono digeriti con enzimi di restrizione, lasciando dietro le ripetizioni dei telomeri e qualche DNA sub-telomerico. Questi sono separati dall'elettroforesi del gel agarosio, trasferiti su una membrana filtrante e ibridati a sonde di oligonucleotide tagliate con chemiluminescenza o radioattività per visualizzare i frammenti di restrizione telomere. Questo approccio, pur richiedendo una maggiore quantità di DNA rispetto ad altre tecniche come la PCR, può misurare la distribuzione della lunghezza del telomere di una popolazione di cellule e consente la misurazione espresso in kilobasi assoluti. Questo manoscritto dimostra una procedura di ibridazione del DNA modificata per determinare la lunghezza del telomero. Il DNA genomico viene prima digerito con enzimi di restrizione (che non taglianoTelomeri) e separati da elettroforesi con agarosio gel. Il gel viene quindi asciugato e il DNA viene denaturato e ibridato in situ ad una sonda oligonucleotidica radiolabeled. Questa ibridazione in situ evita la perdita del DNA del telomere e migliora l'intensità del segnale. Dopo l'ibridazione, i gel vengono immagazzinati utilizzando schermi di fosforo e la lunghezza del telomero viene quantificata utilizzando un programma di grafica. Questa procedura è stata sviluppata dai laboratori del Dott. Woodring Wright e Jerry Shay presso l'Università del Texas Southwestern 1 , 2 . Qui presentiamo una descrizione dettagliata di questa procedura, con alcune modifiche.
Introduction
I telomeri, situati alle estremità dei cromosomi, sono ripetuti nucleotidi della sequenza TTAGGG (sui cromosomi umani) che svolgono un ruolo fondamentale nella protezione delle informazioni genetiche cellulari 3 , 4 , 5 . Telomeres sono diverse migliaia di coppie di base in lunghezza e servono a proteggere l'integrità del resto del cromosoma durante la replicazione del DNA. La replicazione dei cromosomi non è perfetta, con conseguente che le estremità del cromosoma non vengono completamente copiate. Questa inefficienza nella replica viene definita "il problema di replicazione finale" e provoca la perdita di alcune ripetizioni telomere durante ogni ciclo di replica 6 , 7 . La lunghezza del telomere può essere ripristinata dopo la divisione cellulare mediante telomerasi, un enzima che sostituisce le sequenze telomere perse 8 , 9 . La telomerasi, tuttavia, non lo èAttivato nella maggior parte delle cellule somatiche umane e, di conseguenza, nel tempo, i telomeresi accorceranno, determinando una senescenza cellulare 10 . A causa dell'allungamento dei telomeri, i telomeri sono considerati biomarker dell'invecchiamento e rischio di malattie legate all'età 11 , 12 . Inoltre, la lunghezza del telomere può essere influenzata da fattori genetici, ambientali e di stile di vita e altri stimoli come lo stress ossidativo, che indica che la lunghezza del telomero può svolgere un ruolo di biomarker negli studi tossicologici, epidemiologici e comportamentali 13 , 14 , 15 .
Questo articolo dimostra una tecnica per misurare la lunghezza del telomere utilizzando un'analisi modificata del frammento di restrizione terminale (TRF) modificata da Mender e Shay 2 e Kimura et al. 16 , e simili a Herbert, Shay e WrigHt 1 e Haussmann e Mauck 17 . Tradizionalmente, l'analisi TRF comporta una procedura di blot Southern. Le macchie meridionali sono considerate "standard gold" per studiare la lunghezza del telomere e sono attivamente utilizzate per esaminare la lunghezza del telomere di leucociti negli studi epidemiologici 18 . Questa analisi TRF utilizza il DNA genomico digerito lasciando dietro le ripetizioni dei telomeri. I frammenti di DNA vengono quindi separati mediante elettroforesi a gel, denaturati e trasferiti a una membrana di nitrocellulosa. Le sequenze telomere sono ibridizzate ad una sonda di telomere oligonucleotide. Piuttosto che trasferire i telomeresi separati in una membrana, altre tecniche TRF utilizzano tecniche di ibridazione in-gel con e senza denaturazione del DNA. L'inclusione della denaturazione è importante quando si considera la rilevazione di telomeri interstiziali, che sono stati riportati in alcune specie 19 . Le procedure che non hanno la denaturazione fanno solo rilevareI DNA a singolo filamento presentano sovrapposizioni nei telomeresi terminali e non si legano alle sequenze telomeriche interstiziali 18 .
Oltre all'analisi TRF, ci sono diverse altre tecniche per misurare la lunghezza del telomere che ognuno ha i propri vantaggi e svantaggi. La tecnica Flow-FISH può misurare la lunghezza media del telomero di singole cellule di un tipo cellulare distinto utilizzando la citometria a flusso 16 , 20 . Mentre può accuratamente tagliare telomeri con sonde altamente specifiche e ridurre l'errore umano attraverso l'automazione, Flow-FISH è costoso, meno efficiente e richiede campioni freschi e un tecnico altamente qualificato, limitando la sua capacità di studi epidemiologici 16 . Inoltre, questo metodo non tiene conto delle potenziali variazioni del numero di cromosomi nella popolazione cellulare. Un'altra tecnica, qPCR, è ampiamente accettata come mezzo per misurare la lunghezza del telomere per studi epidemiologici <suP class = "xref"> 16 a causa della sua elevata produttività, basso costo e requisito per piccole quantità di DNA rispetto ad altri metodi. Tuttavia, qPCR può misurare solo il contenuto medio del DNA telomerico rispetto a un singolo gene della copia ed è quindi una stima indiretta della lunghezza media del telomero. Fornisce anche un elevato coefficiente di varianza negli studi di confronto, rispetto alle macchie meridionali, portando ad una precisione discutibile 21 .
La procedura TRF ha delle proprie carenze che limitano l'uso di alcuni studi. Le tecniche TRF richiedono una grande quantità di DNA rispetto ad altri metodi (tra 2 e 3 μg per campione). Ciò limita le applicazioni della tecnica per esaminare la lunghezza del telomero di campioni clinici per i quali può essere raccolto un sufficiente DNA genomico e non può essere utilizzato su campioni di DNA degradati. Inoltre, l'analisi TRF è costosa e intensa e richiede 4-5 giorni per produrre risultati. Tuttavia, il TRF produce un basso coefficiente di varianzaConcedendo la sua riproducibilità. Mentre questo protocollo è diverso dalla macchia tradizionale Southern (utilizzando l'ibridazione gel in situ ), le due tecniche sono fondamentalmente le stesse.
La tecnica presentata qui è una combinazione di una blotta Southern e l'ibridazione in gel; Associando il processo di denaturazione del DNA da macchie di Southern con l'ibridazione in gel. Questa combinazione ha il vantaggio aggiunto di una migliore resistenza del segnale della sonda rispetto alla macchia Southern e ha costantemente reso quantificabili risultati all'interno del nostro laboratorio. Inoltre, l'uso di sonde radioattive piuttosto che le sonde chemiluminescenti produce un'intensità del segnale più elevata e consente la visualizzazione e la quantificazione con un fosforimagno, rendendo le analisi del TRF facile da usare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dopo l'elettroforesi, la macchia genomica del DNA è superiore a 800 bp. Ciò può verificarsi se gli enzimi di restrizione sono difettosi o se sono necessari ulteriori enzimi (come sopra descritto). Una seconda possibile spiegazione è che la proteina è ancora attaccata al DNA. Nel determinare la concentrazione del DNA mediante spettrofotometro, il rapporto 260/280 dovrebbe essere di circa 1,8. Se questo rapporto è <1,5, vi è contaminazione di proteine che può interferire con la digestione dell'enz…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono il sostegno dell'Università di Pittsburgh Cancer Institute Biobehavioral oncologia condivisa in funzione che è sostenuta in parte dal premio P30CA047904.
Materials
| Biologics | |||
| Rsa1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0167S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Hinf1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0155S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | electrophoresis grade agarose |
| Optikinase | affymetrix | 78334X 500 UN | T4 Polynucleotide Kinase |
| SYBR Green Nucleic Acid Stain I | ThermoFisher Scientific | S7567 | Syber Green |
| exactGene DNA Ladder 24- kB | Fisher Scientific | BP2580100 | |
| C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5) | Integrated DNA Technologies | Custom ordered DNA oligonucleotide | |
| Gamma-ATP-P32 | Perkin Elmer | BLU502Z | Radioisotope |
| Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit | Qiagen | 13323 | DNA extraction kit |
| GE Illustra Microspin G-25 column | GE Healthcare Life Sciences | 27-5325-01 | For purification of readioactive oligo probe |
| Ficoll 400 | non-ionic synthetic polymer | ||
| Equipment/Software | |||
| Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm) | ThermoFisher Scientific | A5 | Gel electrophoresis |
| Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm) | Corel Life Sciences | 11068020 | Gel electrophoresis |
| Nylon mesh, 50, 12" x 12" | Ted Pellam, Inc | 41-12105 | |
| GE Storage Phosphor Screens | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-75 | |
| Phosphor Screen Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | 63-0035-44 | |
| Isotemp Hybridzation Incubator | Fisher Scientific | 13-247-20Q | |
| Cylindrical hybridization tubes | Fisher Scientific | 13-247-300 | |
| The Belly Dancer orbital shaker | Sigma-aldrich | Z768499-1EA | Orbital shaker |
| Typhoon 9400 | ABI | For imaging of gels and phosphor screens | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad | Version 6.05 | Graphing Program |
| Microsoft Excel | Microsoft | Office 365 | Spreadsheet program |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrp 2000 | Spectrophotometer |
Riferimenti
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