In-gelハイブリダイゼーションを用いたテロメア長の定量化のための末端制限制限断片の解析
Summary
この記事では、テロメアの長さを迅速かつ効率的に直接測定できる改良されたターミナル制限断片解析を使用してテロメアの長さを定量化するための詳細なプロトコルについて説明します。この技術は、テロメアの長さを定量するためのDNAの様々な細胞源に適用することができる。
Abstract
テロメアの長さを測定するには、それぞれに長所と短所があります。従来のアプローチであるテロメア制限フラグメント（TRF）解析は、ゲノムDNAサンプルを制限酵素で消化し、テロメアDNAリピートといくつかのサブテロメリックDNAを残すDNAハイブリダイゼーション技術を利用しています。これらをアガロースゲル電気泳動で分離し、フィルター膜に移し、テロメア制限断片を視覚化するために化学発光または放射能のいずれかで標識されたオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせる。このアプローチは、PCRのような他の技術よりも多量のDNAを必要とするが、細胞集団のテロメア長分布を測定することができ、絶対キロベースで表される測定を可能にする。この原稿は、テロメアの長さを決定するための修飾されたDNAハイブリダイゼーション手順を実証している。まずゲノムDNAを制限酵素（切断しないテロメア）、アガロースゲル電気泳動で分離した。次いで、ゲルを乾燥させ、DNAを変性させ、放射標識オリゴヌクレオチドプローブにその場でハイブリダイズさせる。このin situハイブリダイゼーションにより、テロメアDNAの消失が回避され、シグナル強度が改善されます。ハイブリダイゼーション後、ゲルを蛍光スクリーンを利用して画像化し、テロメア長をグラフプログラムを用いて定量する。この手順は、Drsの研究所によって開発された。テキサス大学南西部1,2 での Woodring WrightとJerry Shay。ここでは、いくつかの変更を加えて、この手順の詳細な説明を示します。
Introduction
テロメアは、染色体の末端に位置し、細胞遺伝情報を保護するのに重要な役割を果たす配列TTAGGG（ヒト染色体上）のヌクレオチド反復である3,4,5 。テロメアは、数千塩基対の長さであり、DNA複製の間、染色体の残りの部分の完全性を保護するのに役立つ。染色体の複製は完全ではないので、染色体の末端が完全にコピーされない。この複製の非効率性は「複製終了の問題」と呼ばれ、複製の各ラウンド6,7の間にいくつかのテロメア反復の損失をもたらす。テロメア長は、失われたテロメア配列8,9を置換する酵素であるテロメラーゼによる細胞分裂後に回復することができる。しかし、テロメラーゼは、ほとんどのヒト体細胞において活性化され、結果として、時間の経過と共にテロメアが短くなり、最終的に細胞の老化が起こる。テロメア短縮のために、テロメアは加齢および加齢性疾患のリスクのバイオマーカーとみなされている11,12 。さらに、テロメアの長さは、テロメアの長さが毒物学的、疫学的および行動学的研究におけるバイオマーカーとしての役割を果たすことができることを示す、遺伝的、環境的、および生活習慣因子および酸化的ストレスなどの他の刺激によって影響され得る13,14,15。
この記事では、Mender and Shay 2およびKimura et al。から適応された改変されたターミナル制限フラグメント（TRF）分析を用いてテロメア長を測定する技術を示す。 16 、Herbert、Shay、Wrigに似ていますht 1とHaussmannとMauck 17 。伝統的に、TRF分析はサザンブロット手順を含む。サザンブロットは、テロメアの長さを研究するための「ゴールドスタンダード」と考えられ、疫学研究では白血球テロメアの長さを調べるために積極的に使用されている18 。このTRF分析は、消化したゲノムDNAを用いてテロメア反復を残す。その後、DNA断片をゲル電気泳動により分離し、変性させてニトロセルロース膜に転写する。テロメア配列は、テロメアオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする。分離したテロメアを膜に転写するのではなく、他のTRF技術はDNAの変性の有無にかかわらずゲル内ハイブリダイゼーション技術を使用する。いくつかの種で報告されている間質性テロメアの検出を考慮する場合、変性の包含は重要である19 。変性工程がない手順では、一本鎖DNAは末端テロメアにオーバーハングし、間質テロメア配列には結合しない18 。
TRF分析の他に、テロメアの長さを測定するためのいくつかの他の方法があり、それぞれに長所と短所があります。 Flow-FISH法は、フローサイトメトリー16,20を用いて別個の細胞型の個々の細胞の平均テロメア長を測定することができる。 Flow-FISHは高価で、効率が悪く、新鮮なサンプルと高度な技術を必要とする技術者を必要とし、疫学研究の能力が限られています16 。さらに、この方法は、細胞集団における染色体数の潜在的変化を説明していない。別の技術、qPCRは、疫学研究のためのテロメア長の測定手段として広く受け入れられている<sup class = "xref"> 16であり、他の方法と比較してDNAの量が少なくて済み、高スループットで低コストであることが要求されます。しかしながら、qPCRは、単一のコピー遺伝子に対する平均テロメアDNA含量のみを測定することができ、したがって、平均テロメア長の間接的推定である。また、サザンブロットと比較して、比較研究において高いばらつき係数が得られ、疑わしい精度21につながる。
TRF手続きには、いくつかの研究での使用を制限する独自の欠点があります。 TRF法は、他の方法と比較して大量のDNAを必要とする（サンプルあたり2〜3μg）。これは、十分なゲノムDNAを収集することができ、分解されたDNAサンプルに使用することができない臨床サンプルのテロメア長を調べることへのこの技術の適用を制限する。さらに、TRF分析は費用がかかり、労働集約的であり、結果を得るのに4~5日を要する。しかし、TRFは、低い分散係数をもたらすその再現性を付与する。このプロトコールは、従来のサザンブロット（ in situゲルハイブリダイゼーションを利用する ）とは異なるが、2つの技術は基本的に同じである。
ここに示す技術は、サザンブロットとイン・ゲルハイブリダイゼーションの組み合わせである。サザンブロットからのDNA変性工程をイン・ゲル・ハイブリダイゼーションと関連付ける工程。この組み合わせは、サザンブロットと比較して改善されたプローブシグナル強度の利点を有し、我々の研究室で定量可能な結果を一貫して得ている。さらに、化学発光プローブではなく放射能プローブを使用することにより、シグナル強度が高くなり、蛍光イメージング装置による可視化と定量が可能になり、TRFの分析がユーザーフレンドリーになります。
Protocol
Representative Results
Discussion
電気泳動後、ゲノムDNAスミアは800bpより高い。これは、制限酵素が欠損している場合、または（上記のような）追加の酵素が必要な場合に発生する可能性があります。もう一つの可能な説明は、タンパク質が依然としてDNAに結合していることである。分光光度計によりDNA濃度を決定する場合、260/280比は約1.8であるべきである。この比が<1.5である場合、制限酵素消化を妨害し得るタンパ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、P30CA047904賞の一部が支持されているピッツバーグ癌研究所生物行動学腫瘍学部共用施設の支援を認めている。
Materials
| Biologics | |||
| Rsa1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0167S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Hinf1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0155S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | electrophoresis grade agarose |
| Optikinase | affymetrix | 78334X 500 UN | T4 Polynucleotide Kinase |
| SYBR Green Nucleic Acid Stain I | ThermoFisher Scientific | S7567 | Syber Green |
| exactGene DNA Ladder 24- kB | Fisher Scientific | BP2580100 | |
| C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5) | Integrated DNA Technologies | Custom ordered DNA oligonucleotide | |
| Gamma-ATP-P32 | Perkin Elmer | BLU502Z | Radioisotope |
| Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit | Qiagen | 13323 | DNA extraction kit |
| GE Illustra Microspin G-25 column | GE Healthcare Life Sciences | 27-5325-01 | For purification of readioactive oligo probe |
| Ficoll 400 | non-ionic synthetic polymer | ||
| Equipment/Software | |||
| Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm) | ThermoFisher Scientific | A5 | Gel electrophoresis |
| Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm) | Corel Life Sciences | 11068020 | Gel electrophoresis |
| Nylon mesh, 50, 12" x 12" | Ted Pellam, Inc | 41-12105 | |
| GE Storage Phosphor Screens | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-75 | |
| Phosphor Screen Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | 63-0035-44 | |
| Isotemp Hybridzation Incubator | Fisher Scientific | 13-247-20Q | |
| Cylindrical hybridization tubes | Fisher Scientific | 13-247-300 | |
| The Belly Dancer orbital shaker | Sigma-aldrich | Z768499-1EA | Orbital shaker |
| Typhoon 9400 | ABI | For imaging of gels and phosphor screens | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad | Version 6.05 | Graphing Program |
| Microsoft Excel | Microsoft | Office 365 | Spreadsheet program |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrp 2000 | Spectrophotometer |
Riferimenti
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