In-gel Hybridization을 이용한 Telomere 길이 정량을위한 수정 된 terminal restriction fragment 분석
Summary
이 기사에서는 텔로미어 길이의 신속하고 효율적인 직접 측정을 제공하는 수정 된 터미널 제한 단편 분석을 사용하여 텔로미어 길이를 정량화하기위한 자세한 프로토콜을 논의합니다. 이 기술은 텔로미어 길이를 정량화하기 위해 DNA의 다양한 세포 공급원에 적용될 수 있습니다.
Abstract
텔로미어 길이를 측정하는 몇 가지 다른 기술이 있습니다. 각각의 장점과 단점이 있습니다. 전통적인 접근 방법 인 Telomere Restriction Fragment (TRF) 분석법은 게놈 DNA 샘플을 제한 효소로 소화시켜 텔로미어 DNA 반복 및 일부 서브 텔로미어 DNA를 남기는 DNA 하이브리드 화 기술을 사용합니다. 이들은 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 분리되고, 필터 멤브레인으로 옮겨지고, 화학 발광 또는 방사능으로 표지 된 올리고 뉴클레오티드 프로브에 하이브리드 화되어 텔로미어 제한 단편을 시각화한다. 이 접근법은 PCR과 같은 다른 기술보다 많은 양의 DNA를 필요로하지만 세포 집단의 텔로미어 길이 분포를 측정 할 수 있으며 절대 킬로베이스로 표현 된 측정을 허용합니다. 이 원고는 텔로미어 길이를 결정하기위한 수정 된 DNA 하이브리드 화 과정을 보여줍니다. 게놈 DNA는 먼저 제한 효소 (절단하지 않는 게놈텔로미어), 아가 로스 겔 전기 영동으로 분리 하였다. 이어서, 겔을 건조시키고 DNA를 변성시키고 방사성 표지 된 올리고 뉴클레오티드 프로브 에 인 시츄 하이브리드 화시킨다. 이 in situ 하이브리드 화는 텔로미어 DNA의 손실을 피하고 신호 강도를 향상시킵니다. 하이브 리다이 제이션 후에, 겔은 형광체 스크린을 이용하여 영상화되고, 텔로미어 길이는 그래프 프로그램을 사용하여 정량화된다. 이 절차는 Drs의 실험실에서 개발되었습니다. Woodring Wright와 Jerry Shay는 텍사스 대학교 남서부 대학교 1 학년 2 학년입니다. 여기에서는 몇 가지 수정 사항을 포함하여이 절차에 대해 자세히 설명합니다.
Introduction
텔로미어 (telomeres)는 염색체의 말단에 위치하고 있으며, 세포 유전 정보를 보호하는 데 중요한 역할을하는 TTAGGG (인간 염색체상의 서열)의 뉴클레오타이드 반복 서열이다 3 , 4 , 5 . 텔로미어는 수천 개의 염기쌍으로 DNA 복제 중에 나머지 염색체의 무결성을 보호하는 역할을합니다. 염색체 복제가 완벽하지 않아서 염색체의 끝이 완전히 복사되지 않습니다. 이러한 복제의 비효율은 "최종 복제 문제"로 불리고 각 복제 라운드 동안 일부 텔로미어 반복을 잃게됩니다 6 , 7 . 텔로미어 길이는 잃어버린 텔로미어 서열 8 , 9 를 대체하는 효소 인 텔로 머라 아제에 의한 세포 분열 이후에 회복 될 수있다. 그러나, 텔로 머라 아제는결과적으로, 시간이 지남에 따라 텔로미어는 짧아지고 결국 세포 노화가 일어난다. 텔로미어 단축으로 인해 텔로미어는 노화와 노화 관련 질병의 위험성을 나타내는 바이오 마커로 간주됩니다 11,12 . 또한 텔로미어 길이는 유전 적, 환경 적, 생활 양식의 요인 및 산화 스트레스와 같은 다른 자극에 영향을 받아 텔로미어 길이가 독성학, 역학 및 행동 연구에서 바이오 마커 역할을 할 수 있음을 나타냅니다 13 , 14 , 15 .
이 기사는 Mender and Shay 2 와 Kimura et al.이 채택한 modified terminal restriction fragment (TRF) 분석을 사용하여 텔로미어 길이를 측정하는 기술을 설명합니다 . 16 , Herbert, Shay 및 Wrig와 비슷하다.ht 1 과 Haussmann과 Mauck 17 . 전통적으로, TRF 분석은 서던 블롯 절차를 포함합니다. 서던 블롯은 텔로미어 길이를 연구하기위한 "금 표준"으로 간주되며 역학 연구에서 백혈구 텔로미어 길이를 검사하는데 적극적으로 사용됩니다 18 . 이 TRF 분석은 텔로미어 반복을 남겨두고 소화 된 게놈 DNA를 사용합니다. 그런 다음 DNA 단편을 겔 전기 영동으로 분리하고 변성시키고 니트로 셀룰로오스 막으로 옮긴다. 텔로미어 서열은 텔로미어 올리고 뉴클레오티드 프로브에 하이브리드 화된다. 분리 된 텔로미어를 멤브레인으로 옮기는 대신, 다른 TRF 기술은 DNA 변성의 유무에 관계없이 in-gel hybridization 기술을 사용합니다. 변성의 포함은 일부 종 19 에서보고 된 간질 텔로미어의 검출을 고려할 때 중요합니다. 변성 단계가없는 절차는 th단일 가닥 DNA는 말단 텔로미어에서 오버행하고 간질 텔로미어 서열 18 에는 결합하지 않을 것이다.
TRF 분석 외에도 텔로미어 길이를 측정하는 몇 가지 다른 기술이 있습니다. 각각의 장점과 단점이 있습니다. Flow-FISH 기술은 유동 세포 계측법을 사용하여 별개의 세포 유형의 개별 세포의 평균 텔로미어 길이를 측정 할 수 있습니다 16 , 20 . Flow-FISH는 자동화를 통해 텔로미어에 고도로 특화된 프로브를 정확하게 표기하고 사람의 실수를 줄이는 한편 비용이 많이 들고 효율적이지 않으며 신선한 샘플과 숙련 된 기술자가 필요하기 때문에 전염병 연구에 대한 능력이 제한됩니다 16 . 또한,이 방법은 세포 집단의 염색체 수의 잠재적 변화를 설명하지 못한다. 또 다른 기술인 qPCR은 전염병 연구를위한 텔로미어 길이를 측정하는 수단으로 널리 받아 들여지고있다 <sup class = "xref"> 16은 다른 방법에 비해 적은 양의 DNA에 대한 높은 처리량, 저비용 및 요구 조건 때문에 발생합니다. 그러나, qPCR은 단일 복사 유전자에 비례하여 평균 텔로미어 DNA 함량만을 측정 할 수 있으며, 따라서 평균 텔로미어 길이의 간접적 인 추정치이다. 또한 남부 연구와 비교하여 비교 연구에서 높은 변동 계수를 산출하여 의심스러운 정확도 21로 이어진다.
재단 절차에는 일부 연구에 대한 사용을 제한하는 자체 결함이 있습니다. TRF 기술은 다른 방법에 비해 많은 양의 DNA가 필요합니다 (시료 당 2 ~ 3 μg). 이것은 충분한 게놈 DNA가 수집 될 수 있고 분해 된 DNA 샘플에는 사용할 수없는 임상 샘플의 텔로미어 길이를 검사하는 기술의 적용을 제한합니다. 또한, TRF 분석은 값 비싸고 노동 집약적이어서 결과를 산출하는 데 4-5 일이 걸립니다. 그러나 TRF는 낮은 변동 계수를 산출합니다.재현성을 부여합니다. 이 프로토콜은 기존의 Southern blot ( in situ gel hybridization을 사용)과 다르지만, 두 기술은 근본적으로 같습니다.
여기에 제시된 기술은 Southern blot과 in-gel hybridization의 조합입니다. Southern blots의 DNA 변성 단계를 in-gel hybridization과 관련 짓습니다. 이 조합은 서던 블롯에 비해 향상된 프로브 신호 강도의 추가 이점을 가지며 우리 연구실 내에서 지속적으로 정량화 가능한 결과를 산출했습니다. 또한 화학 발광 탐침보다 방사능 탐침을 사용하면 신호 강도가 높아지며 phosphorimager로 시각화 및 정량화가 가능하여 사용자 친화적 인 TRF 분석이 가능합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
전기 영동 후 게놈 DNA 번짐은 800 bp보다 높습니다. 이는 제한 효소가 결함이거나 추가 효소 (위에서 설명한 바와 같음)가 필요한 경우 발생할 수 있습니다. 두 번째 가능한 설명은 단백질이 여전히 DNA에 붙어 있다는 것입니다. 분광 광도계로 DNA 농도를 측정 할 때 260/280 비율은 약 1.8이어야합니다. 이 비율이 <1.5 인 경우 제한 효소 소화를 방해 할 수있는 단백질 오염이 있습니다. DNA 샘플을 재조직…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 부분적으로 P30CA047904 상을 수상한 Pittsburgh Cancer Institute Biobehavioral 종양학 공유 시설의 지원을 인정합니다.
Materials
| Biologics | |||
| Rsa1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0167S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Hinf1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0155S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | electrophoresis grade agarose |
| Optikinase | affymetrix | 78334X 500 UN | T4 Polynucleotide Kinase |
| SYBR Green Nucleic Acid Stain I | ThermoFisher Scientific | S7567 | Syber Green |
| exactGene DNA Ladder 24- kB | Fisher Scientific | BP2580100 | |
| C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5) | Integrated DNA Technologies | Custom ordered DNA oligonucleotide | |
| Gamma-ATP-P32 | Perkin Elmer | BLU502Z | Radioisotope |
| Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit | Qiagen | 13323 | DNA extraction kit |
| GE Illustra Microspin G-25 column | GE Healthcare Life Sciences | 27-5325-01 | For purification of readioactive oligo probe |
| Ficoll 400 | non-ionic synthetic polymer | ||
| Equipment/Software | |||
| Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm) | ThermoFisher Scientific | A5 | Gel electrophoresis |
| Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm) | Corel Life Sciences | 11068020 | Gel electrophoresis |
| Nylon mesh, 50, 12" x 12" | Ted Pellam, Inc | 41-12105 | |
| GE Storage Phosphor Screens | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-75 | |
| Phosphor Screen Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | 63-0035-44 | |
| Isotemp Hybridzation Incubator | Fisher Scientific | 13-247-20Q | |
| Cylindrical hybridization tubes | Fisher Scientific | 13-247-300 | |
| The Belly Dancer orbital shaker | Sigma-aldrich | Z768499-1EA | Orbital shaker |
| Typhoon 9400 | ABI | For imaging of gels and phosphor screens | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad | Version 6.05 | Graphing Program |
| Microsoft Excel | Microsoft | Office 365 | Spreadsheet program |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrp 2000 | Spectrophotometer |
Riferimenti
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