Modifisert Terminal Restriksjonsfragmentanalyse for kvantifisering av telomer lengde ved bruk av in-gel hybridisering
Summary
I denne artikkelen diskuteres en detaljert protokoll for kvantifisering av telomerlengden ved hjelp av en modifisert terminalrestriksjonsfragmentanalyse som gir rask og effektiv direkte måling av telomerlengden. Denne teknikken kan brukes på en rekke cellekilder til DNA for kvantifisering av telomerlengden.
Abstract
Det finnes flere forskjellige teknikker for måling av telomer lengde, hver med sine egne fordeler og ulemper. Den tradisjonelle tilnærmingen, Telomere Restriction Fragment (TRF) analyse, benytter en DNA-hybridiseringsteknikk hvorved genomiske DNA-prøver spaltes med restriksjonsenzymer, etterlater telomere DNA-gjentagelser og noe subteltomer DNA. Disse separeres av agarosegelelektroforese, overføres til en filtermembran og hybridiseres til oligonukleotidprober merket med enten kjemiluminescens eller radioaktivitet for å visualisere telomer-restriksjonsfragmenter. Denne tilnærmingen, mens den krever en større mengde DNA enn andre teknikker som PCR, kan måle telomer-lengdefordelingen av en populasjon av celler og tillater måling uttrykt i absolutte kilobaser. Dette manuskriptet demonstrerer en modifisert DNA-hybridiseringsprosedyre for å bestemme telomerlengden. Genomisk DNA blir først fordøyd med restriktjonsenzymer (som ikke kuttesTelomerer) og separert av agarosegelelektroforese. Gelen blir deretter tørket og DNA-denaturert og hybridisert in situ til en radiomerket oligonukleotidprobe. Denne in situ hybridiseringen unngår tap av telomere DNA og forbedrer signalintensiteten. Etter hybridisering blir gelene avbildet ved bruk av fosforskjermbilder og telomerlengden kvantifiseres ved hjelp av et grafeprogram. Denne prosedyren ble utviklet av laboratoriene i Drs. Woodring Wright og Jerry Shay ved University of Texas Southwestern 1 , 2 . Her presenterer vi en detaljert beskrivelse av denne prosedyren, med noen modifikasjoner.
Introduction
Telomerer, som ligger i endene av kromosomer, er nukleotidrepetisjoner av sekvensen TTAGGG (på humane kromosomer) som spiller en kritisk rolle for å beskytte cellegenetisk informasjon 3 , 4 , 5 . Telomerer er flere tusen basepar i lengde og tjener til å beskytte integriteten til resten av kromosomet under DNA-replikasjon. Replikasjon av kromosomer er ikke perfekt, noe som resulterer i at endene av kromosomet ikke blir fullstendig kopiert. Denne ineffektiviteten i replikasjon kalles "end replikasjonsproblemet" og resulterer i tap av noen av telomere-gjentakelsene under hver omgang av replikering 6 , 7 . Telomer lengde kan gjenopprettes etter celledeling ved telomerase, et enzym som erstatter de tapt telomere sekvensene 8 , 9 . Telomerase er imidlertid ikkeAktivert i de fleste menneskelige somatiske celler, og som et resultat vil telomerer over tid forkorte, noe som til slutt resulterer i cellulær senescens 10 . På grunn av telomereforkortelse betraktes telomerer som en biomarkør av aldring og risiko for aldersrelaterte sykdommer 11 , 12 . I tillegg kan telomer lengde påvirkes av genetiske, miljømessige og livsstilsfaktorer og andre stimuli som oksidativt stress, noe som indikerer at telomer lengde kan spille en rolle som biomarkør i toksikologiske, epidemiologiske og atferdsstudier 13 , 14 , 15 .
Denne artikkelen demonstrerer en teknikk for å måle telomerlengden ved bruk av en modifisert terminalrestriksjonsfragment (TRF) analyse tilpasset fra Mender og Shay 2 og Kimura et al. 16 , og lik Herbert, Shay og WrigHt 1 og haussmann og Mauck 17 . Tradisjonelt involverer TRF-analyse en Southern blot-prosedyre. Southern blots betraktes som "gullstandarden" for å studere telomererlengde og brukes aktivt til å undersøke leukocyttelomererlengde i epidemiologiske studier 18 . Denne TRF-analysen bruker fordøyd genomisk DNA som etterlater telomere-gjentakelsene. DNA-fragmentene separeres deretter ved gelelektroforese, denatureres og overføres til en nitrocellulosemembran. Telomere-sekvensene hybridiseres til en telomer-oligonukleotidprobe. I stedet for å overføre de separerte telomerer til en membran, bruker andre TRF-teknikker in-gel hybridiseringsteknikker med og uten denaturering av DNA. Inkluderingen av denaturering er viktig når man vurderer deteksjon av interstitiale telomerer, som er blitt rapportert hos noen arter 19 . Prosedyrer som mangler denatureringstrinn, oppdager bare detE enkeltstrenget DNA overheng ved terminale telomerer og vil ikke binde seg til interstitiale telomere sekvenser 18 .
Foruten TRF analyse er det flere andre teknikker for måling av telomere lengde som hver har sine egne fordeler og ulemper. Flow-FISH teknikken kan måle gjennomsnittlig telomer lengde av individuelle celler av en distinkt celletype ved hjelp av flytcytometri 16 , 20 . Selv om det er nøyaktig å merke telomerer med svært spesifikke sonder og redusere menneskelig feil gjennom automatisering, er Flow-FISH dyrere, mindre effektiv og krever friske prøver og en høyt kvalifisert tekniker som begrenser sin evne til epidemiologi studier 16 . I tillegg utgjør denne metoden ikke potensielle endringer i antall kromosomer i cellepopulasjonen. En annen teknikk, qPCR, er allment akseptert som et middel til å måle telomerlengden for epidemiologi studier <suP class = "xref"> 16 på grunn av sin høye gjennomstrømning, lave kostnader og krav til små mengder DNA sammenlignet med andre metoder. Imidlertid kan qPCR kun måle gjennomsnittlig telomerisk DNA-innhold i forhold til et enkeltkopieringsgen og er således et indirekte estimat av gjennomsnittlig telomerlengde. Det gir også en høy variasjonskoeffisient i sammenligningsstudier, sammenlignet med sørlige blott, noe som fører til tvilsom nøyaktighet 21 .
TRF-prosedyren har sine egne mangler som begrenser bruken av dette til noen studier. TRF teknikker krever en stor mengde DNA sammenlignet med andre metoder (mellom 2 og 3 μg per prøve). Dette begrenser teknikkens anvendelser for å undersøke telomererlengden av kliniske prøver for hvilke tilstrekkelig genomisk DNA kan samles, og kan ikke brukes på nedbrytte DNA-prøver. I tillegg er TRF-analysen kostbar og arbeidsintensiv, og krever 4-5 dager for å gi resultater. Imidlertid gir TRF en lav variasjonskoeffisientGi reproduserbarhet. Mens denne protokollen er forskjellig fra den tradisjonelle Southern blot (ved bruk av in situ gel hybridisering), er de to teknikkene i utgangspunktet de samme.
Teknikken som presenteres her er en kombinasjon av en Southern blot og in-gel hybridisering; Assosierer DNA-denatureringstrinnet fra Southern blots med in-gel hybridiseringen. Denne kombinasjonen har den ekstra fordelen av forbedret sondesignalstyrke sammenlignet med Southern blot og har konsekvent gitt kvantifiserbare resultater i laboratoriet. I tillegg gir bruk av radioaktive sonder snarere enn kjemiluminescerende prober høyere signalintensitet og muliggjør visualisering og kvantifisering med en fosforimager, noe som gjør analysene av TRF-brukervennlige.
Protocol
Representative Results
Discussion
Etter elektroforese er det genomiske DNA-smear høyere enn 800 bp. Dette kan oppstå hvis restriktjonsenzymer er defekte, eller hvis det er behov for ytterligere enzymer (som beskrevet ovenfor). En annen mulig forklaring er at proteinet fortsatt er festet til DNA. Ved bestemmelse av DNA-konsentrasjonen ved spektrofotometer, bør 260/280 forholdet være rundt 1,8. Hvis dette forholdet er <1,5, er det proteinforurensning som kan forstyrre restriktionsenzymfordøyelsen. Enten måtte DNA-prøven bli isolert, eller protei…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkjenner støtten fra University of Pittsburgh Cancer Institute Biobehavioral Oncology felles anlegg som delvis støttes ved pris P30CA047904.
Materials
| Biologics | |||
| Rsa1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0167S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Hinf1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0155S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | electrophoresis grade agarose |
| Optikinase | affymetrix | 78334X 500 UN | T4 Polynucleotide Kinase |
| SYBR Green Nucleic Acid Stain I | ThermoFisher Scientific | S7567 | Syber Green |
| exactGene DNA Ladder 24- kB | Fisher Scientific | BP2580100 | |
| C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5) | Integrated DNA Technologies | Custom ordered DNA oligonucleotide | |
| Gamma-ATP-P32 | Perkin Elmer | BLU502Z | Radioisotope |
| Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit | Qiagen | 13323 | DNA extraction kit |
| GE Illustra Microspin G-25 column | GE Healthcare Life Sciences | 27-5325-01 | For purification of readioactive oligo probe |
| Ficoll 400 | non-ionic synthetic polymer | ||
| Equipment/Software | |||
| Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm) | ThermoFisher Scientific | A5 | Gel electrophoresis |
| Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm) | Corel Life Sciences | 11068020 | Gel electrophoresis |
| Nylon mesh, 50, 12" x 12" | Ted Pellam, Inc | 41-12105 | |
| GE Storage Phosphor Screens | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-75 | |
| Phosphor Screen Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | 63-0035-44 | |
| Isotemp Hybridzation Incubator | Fisher Scientific | 13-247-20Q | |
| Cylindrical hybridization tubes | Fisher Scientific | 13-247-300 | |
| The Belly Dancer orbital shaker | Sigma-aldrich | Z768499-1EA | Orbital shaker |
| Typhoon 9400 | ABI | For imaging of gels and phosphor screens | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad | Version 6.05 | Graphing Program |
| Microsoft Excel | Microsoft | Office 365 | Spreadsheet program |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrp 2000 | Spectrophotometer |
Riferimenti
- Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. Analysis of telomeres and telomerase. Curr Protoc Cell Biol. , 16 (2003).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis. Bio Protoc. 5 (22), (2015).
- Blackburn, E. H. Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).
- Greider, C. W. Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).
- Szostak, J. W. DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).
- Watson, J. M., Riha, K. Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah – A Mini-Review. Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).
- Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M. Telomeres-Structure, Function, and Regulation. Exp Cell Res. 319 (2), 133-141 (2013).
- MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. Telomerase Regulation from Beginning to the End. Genes (Basel). 7 (9), 64 (2016).
- Fouquerel, E., Opresko, P. Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair. Photochem Photobiol. , (2016).
- Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence. Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).
- Opresko, P. L., Shay, J. W. Telomere-Associated Aging Disorders. Ageing Res Rev. , 1568-1637 (2016).
- Chiodi, I., Mondello, C. Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).
- Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
- Lindqvist, D., et al. Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging. Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).
- Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M. Telomeres in Molecular Epidemiology Studies. Prog Mol Biol Transl Sci. 125 (113), (2014).
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Haussmann, M. F., Mauck, R. A. TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation. Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).
- Nussey, D. H., et al. Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology. Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).
- Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening. Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).
- Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH). Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).
- Sanders, J. L., Newman, A. B. Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither. Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).
- Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts. Nat Commun. 6, 8214 (2015).
