Модифицированный анализ фрагментарных фрагментов для количественного определения длины теломера с использованием гибридизации в геле
Summary
В этой статье обсуждается подробный протокол для количественной оценки длины теломер с использованием модифицированного терминального рестрикционного фрагмента, который обеспечивает быстрое и эффективное прямое измерение длины теломер. Этот метод может быть применен к различным клеточным источникам ДНК для количественной оценки длины теломер.
Abstract
Существует несколько различных методов измерения длины теломер, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. В традиционном подходе, анализах фрагментации теломер (TRF) используется технология гибридизации ДНК, в которой образцы геномной ДНК расщепляются рестрикционными ферментами, оставляя повторные повторы ДНК теломер и некоторые суб-теломерные ДНК. Их разделяют электрофорезом в агарозном геле, переносят на фильтровальную мембрану и гибридизовывают с олигонуклеотидными зондами, меченными либо хемилюминесценцией, либо радиоактивностью, чтобы визуализировать фрагменты рестрикции теломер. Такой подход, требующий большего количества ДНК, чем другие методы, такие как ПЦР, может измерять распределение длины теломер популяции клеток и позволяет измерять, выраженные в абсолютных килобазах. Эта рукопись демонстрирует модифицированную процедуру гибридизации ДНК для определения длины теломер. Геномную ДНК сначала расщепляют рестрикционными ферментами (которые не режутТеломеры) и разделяют электрофорезом в агарозном геле. Затем гель сушат и ДНК денатурируют и гибридизуют in situ с радиоактивно меченным олигонуклеотидным зондом. Эта гибридизация di situ позволяет избежать потери ДНК теломер и улучшает интенсивность сигнала. После гибридизации гели визуализируются с использованием экранов люминофора, а длина теломера определяется количественно с помощью графической программы. Эта процедура была разработана лабораториями Drs. Вудринг Райт и Джерри Шей в Университете Техаса Юго-Западный 1 , 2 . Здесь мы приводим подробное описание этой процедуры с некоторыми изменениями.
Introduction
Теломеры, расположенные на концах хромосом, представляют собой нуклеотидные повторы последовательности TTAGGG (на человеческих хромосомах), которые играют критическую роль в защите клеточной генетической информации 3 , 4 , 5 . Теломеры составляют несколько тысяч пар оснований в длину и служат для защиты целостности остальной части хромосомы во время репликации ДНК. Репликация хромосом не идеальна, в результате чего концы хромосомы не полностью копируются. Эта неэффективность в репликации называется «проблемой конечной репликации» и приводит к потере некоторых повторов теломер в течение каждого раунда репликации 6 , 7 . Длина теломера может быть восстановлена после деления клеток теломеразой, ферментом, который заменяет потерянные последовательности теломер 8 , 9 . Теломераза, однако, неАктивируется в большинстве соматических клеток человека, и в результате со временем теломеры сокращаются, что в конечном итоге приводит к клеточному старению 10 . Из-за сокращения теломер теломеры рассматриваются как биомаркер старения и риск развития возрастных заболеваний 11 , 12 . Кроме того, на длину теломер могут влиять генетические, экологические и факторы образа жизни и другие стимулы, такие как окислительный стресс, что указывает на то, что длина теломер может играть роль биомаркера в токсикологических, эпидемиологических и поведенческих исследованиях 13 , 14 , 15 .
В этой статье демонстрируется методика измерения длины теломер с использованием модифицированного анализа терминального рестрикционного фрагмента (TRF), адаптированного из Mender и Shay 2 и Kimura et al. 16 , и аналогично Герберту, Шей и РигуHt 1 и Haussmann and Mauck 17 . Традиционно анализ TRF включает процедуру Саузерн-блоттинга. Саузерн-блоты считаются «золотым стандартом» для изучения длины теломер и активно используются для изучения длины теломер лейкоцитов в эпидемиологических исследованиях 18 . Этот анализ TRF использует переваренную геномную ДНК, остающуюся после повторов теломер. Затем фрагменты ДНК отделяют гель-электрофорезом, денатурируют и переносят на нитроцеллюлозную мембрану. Последовательности теломер гибридизуются с олигонуклеотидным зондом теломер. Вместо переноса отделенных теломер на мембрану другие методы TRF используют методы гибридизации в геле с денатурацией ДНК и без нее. Включение денатурации важно при рассмотрении обнаружения междоузельных теломер, о чем сообщалось у некоторых видов 19 . Процедуры, в которых отсутствуют денатурирующие шаги,Одноцепочечные выемки ДНК в концевых теломерах и не будут связываться с интерстициальными последовательностями теломер 18 .
Помимо анализа TRF, существует несколько других методов измерения длины теломер, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Метод Flow-FISH может измерять среднюю длину теломер отдельных клеток отдельного типа клеток с использованием проточной цитометрии 16 , 20 . Хотя он может точно маркировать теломеры с помощью высокоспецифических зондов и уменьшать человеческую ошибку с помощью автоматизации, Flow-FISH является дорогостоящим, менее эффективным и требует свежих образцов и высококвалифицированного техника, ограничивая его возможности для эпидемиологических исследований 16 . Кроме того, этот метод не учитывает потенциальные изменения количества хромосом в популяции клеток. Другая методика, qPCR, широко используется в качестве средства измерения длины теломер для эпидемиологических исследований <suP class = "xref"> 16 из-за его высокой пропускной способности, низкой стоимости и потребности в небольших количествах ДНК по сравнению с другими методами. Однако qPCR может измерять только среднее содержание теломерной ДНК по отношению к одному копирующему гену и, таким образом, является косвенной оценкой средней длины теломер. Это также приводит к большому коэффициенту дисперсии в сравнительных исследованиях по сравнению с южными блотами, что приводит к сомнительной точности 21 .
Процедура TRF имеет свои недостатки, которые ограничивают ее использование для некоторых исследований. Методы TRF требуют большого количества ДНК по сравнению с другими методами (от 2 до 3 мкг на образец). Это ограничивает применение техники для изучения длины теломер клинических образцов, для которых может быть собрана достаточная геномная ДНК и не может быть использована на деградированных образцах ДНК. Кроме того, анализ TRF является дорогостоящим и трудоемким, что требует 4-5 дней для получения результатов. Однако TRF дает низкий коэффициент дисперсииПредоставляя его воспроизводимость. Хотя этот протокол отличается от традиционного Саузерн-блоттинга (с использованием гибридизации на месте in situ), эти два метода принципиально одинаковы.
Представленная здесь методика представляет собой комбинацию Саузерн-блоттинга и in-gel-гибридизации; Связывая стадию денатурации ДНК с Саузерн-блоттингом с гибридизацией in-gel. Эта комбинация обладает дополнительным преимуществом улучшенной мощности зондирующего сигнала по сравнению с Саузерн-блоттингом и последовательно дает количественные результаты в нашей лаборатории. Кроме того, использование радиоактивных зондов, а не хемилюминесцентных зондов, дает более высокую интенсивность сигнала и позволяет визуализировать и количественно с помощью фосфоримагера, делая анализ TRF удобным для пользователя.
Protocol
Representative Results
Discussion
После электрофореза геномный ДНК-мазок выше 800 пар оснований. Это может произойти, если рестрикционные ферменты являются дефектными или необходимы дополнительные ферменты (как описано выше). Второе возможное объяснение состоит в том, что белок все еще прикреплен к ДНК. При определении …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают поддержку Университета Питтсбургского института рака по биобезопасной онкологии, которая частично поддерживается наградой P30CA047904.
Materials
| Biologics | |||
| Rsa1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0167S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Hinf1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0155S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | electrophoresis grade agarose |
| Optikinase | affymetrix | 78334X 500 UN | T4 Polynucleotide Kinase |
| SYBR Green Nucleic Acid Stain I | ThermoFisher Scientific | S7567 | Syber Green |
| exactGene DNA Ladder 24- kB | Fisher Scientific | BP2580100 | |
| C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5) | Integrated DNA Technologies | Custom ordered DNA oligonucleotide | |
| Gamma-ATP-P32 | Perkin Elmer | BLU502Z | Radioisotope |
| Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit | Qiagen | 13323 | DNA extraction kit |
| GE Illustra Microspin G-25 column | GE Healthcare Life Sciences | 27-5325-01 | For purification of readioactive oligo probe |
| Ficoll 400 | non-ionic synthetic polymer | ||
| Equipment/Software | |||
| Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm) | ThermoFisher Scientific | A5 | Gel electrophoresis |
| Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm) | Corel Life Sciences | 11068020 | Gel electrophoresis |
| Nylon mesh, 50, 12" x 12" | Ted Pellam, Inc | 41-12105 | |
| GE Storage Phosphor Screens | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-75 | |
| Phosphor Screen Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | 63-0035-44 | |
| Isotemp Hybridzation Incubator | Fisher Scientific | 13-247-20Q | |
| Cylindrical hybridization tubes | Fisher Scientific | 13-247-300 | |
| The Belly Dancer orbital shaker | Sigma-aldrich | Z768499-1EA | Orbital shaker |
| Typhoon 9400 | ABI | For imaging of gels and phosphor screens | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad | Version 6.05 | Graphing Program |
| Microsoft Excel | Microsoft | Office 365 | Spreadsheet program |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrp 2000 | Spectrophotometer |
Riferimenti
- Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. Analysis of telomeres and telomerase. Curr Protoc Cell Biol. , 16 (2003).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis. Bio Protoc. 5 (22), (2015).
- Blackburn, E. H. Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).
- Greider, C. W. Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).
- Szostak, J. W. DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).
- Watson, J. M., Riha, K. Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah – A Mini-Review. Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).
- Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M. Telomeres-Structure, Function, and Regulation. Exp Cell Res. 319 (2), 133-141 (2013).
- MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. Telomerase Regulation from Beginning to the End. Genes (Basel). 7 (9), 64 (2016).
- Fouquerel, E., Opresko, P. Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair. Photochem Photobiol. , (2016).
- Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence. Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).
- Opresko, P. L., Shay, J. W. Telomere-Associated Aging Disorders. Ageing Res Rev. , 1568-1637 (2016).
- Chiodi, I., Mondello, C. Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).
- Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
- Lindqvist, D., et al. Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging. Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).
- Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M. Telomeres in Molecular Epidemiology Studies. Prog Mol Biol Transl Sci. 125 (113), (2014).
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Haussmann, M. F., Mauck, R. A. TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation. Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).
- Nussey, D. H., et al. Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology. Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).
- Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening. Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).
- Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH). Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).
- Sanders, J. L., Newman, A. B. Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither. Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).
- Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts. Nat Commun. 6, 8214 (2015).
