Análisis de fragmentos de restricción de terminales modificados para cuantificar longitud de telómeros mediante hibridación en gel
Summary
En este artículo, se discute un protocolo detallado para cuantificar la longitud de los telómeros usando un análisis de fragmentos de restricción terminal modificado que proporciona una medición directa rápida y eficiente de la longitud de los telómeros. Esta técnica puede aplicarse a una variedad de fuentes celulares de ADN para cuantificar la longitud de los telómeros.
Abstract
Existen varias técnicas diferentes para medir la longitud de los telómeros, cada una con sus propias ventajas y desventajas. El enfoque tradicional, el análisis de fragmentos de restricción Telomere (TRF), utiliza una técnica de hibridación de ADN mediante la cual las muestras de ADN genómico son digeridas con enzimas de restricción, dejando atrás las repeticiones del telómero y algún ADN sub-telomérico. Éstos se separan mediante electroforesis en gel de agarosa, se transfieren a una membrana de filtro y se hibridan con sondas de oligonucleótidos marcadas con quimioluminiscencia o radioactividad para visualizar fragmentos de restricción de telómeros. Este enfoque, aunque requiere una mayor cantidad de ADN que otras técnicas como la PCR, puede medir la distribución de la longitud de telómeros de una población de células y permite la medición expresada en kilobases absolutas. Este manuscrito demuestra un procedimiento de hibridación de ADN modificado para determinar la longitud de los telómeros. El ADN genómico se digiere primero con enzimas de restricción (que no se cortanTelómeros) y separados por electroforesis en gel de agarosa. El gel se seca entonces y el ADN se desnaturaliza y se hibrida in situ a una sonda oligonucleotídica radiomarcada. Esta hibridación di situ evita la pérdida de ADN del telómero y mejora la intensidad de la señal. Después de la hibridación, se forman imágenes de los geles utilizando pantallas de fósforo y se cuantifica la longitud del telómero utilizando un programa de representación gráfica. Este procedimiento fue desarrollado por los laboratorios de los Dres. Woodring Wright y Jerry Shay en la Universidad de Texas Southwestern 1 , 2 . A continuación se presenta una descripción detallada de este procedimiento, con algunas modificaciones.
Introduction
Los telómeros, situados en los extremos de los cromosomas, son repeticiones nucleotídicas de la secuencia TTAGGG (en los cromosomas humanos) que juegan un papel crítico en la protección de la información genética celular 3 , 4 , 5 . Los telómeros tienen varios miles de pares de bases de longitud y sirven para proteger la integridad del resto del cromosoma durante la replicación del ADN. La replicación de los cromosomas no es perfecta, resultando en que los extremos del cromosoma no estén completamente copiados. Esta ineficiencia en la replicación se denomina el "problema de replicación final" y resulta en la pérdida de algunas de las repeticiones telomere durante cada ronda de replicación [ 6 , 7] . Telomere longitud puede ser restaurada después de la división celular por la telomerasa, una enzima que sustituye a las secuencias de telómeros perdidos 8 , 9 . La telomerasa, sin embargo, no esActivado en la mayoría de las células somáticas humanas y como resultado, con el tiempo, los telómeros se acortan, dando lugar eventualmente a la senescencia celular [ 10] . Debido al acortamiento de telómeros, los telómeros se consideran un biomarcador del envejecimiento y el riesgo de enfermedades relacionadas con la edad 11 , 12 . Además, la longitud de los telómeros puede verse afectada por factores genéticos, ambientales y de estilo de vida y otros estímulos como el estrés oxidativo, lo que indica que la longitud de telómeros puede desempeñar un papel como biomarcador en estudios toxicológicos, epidemiológicos y de comportamiento 13 , 14 , 15 .
Este artículo demuestra una técnica para medir longitud de telómeros utilizando un análisis de fragmentos de restricción terminal modificado (TRF) adaptado de Mender y Shay 2 y Kimura et al. 16 , y similar a Herbert, Shay y WrigHt 1 y Haussmann y Mauck 17 . Tradicionalmente, el análisis de TRF implica un procedimiento de transferencia de Southern. Southern blots se consideran el "estándar de oro" para estudiar la longitud telómero y se utilizan activamente para examinar la longitud de los telómeros leucocitarios en estudios de epidemiología [ 18] . Este análisis de TRF utiliza ADN genómico digerido que deja atrás las repeticiones teloméricas. Los fragmentos de ADN se separan después por electroforesis en gel, se desnaturalizan y se transfieren a una membrana de nitrocelulosa. Las secuencias de los telómeros se hibridan con una sonda de oligonucleótidos de telómeros. En lugar de transferir los telómeros separados a una membrana, otras técnicas de TRF utilizan técnicas de hibridación en gel con y sin desnaturalización del ADN. La inclusión de la desnaturalización es importante cuando se considera la detección de telómeros intersticiales, que han sido reportados en algunas especies [ 19] . Los procedimientos que carecen de pasos desnaturalizantes sólo detectanE simple hundido ADN sobresale en telómeros terminales y no se vinculará a las secuencias de telómeros intersticiales [ 18] .
Además del análisis de la TRF, existen varias otras técnicas para medir la longitud del telómero, cada una de las cuales tiene sus propias ventajas y desventajas. La técnica Flow-FISH puede medir la longitud media de telómeros de células individuales de un tipo celular distinto mediante citometría de flujo 16 , 20 . Mientras que puede etiquetar con precisión los telómeros con sondas muy específicas y reducir el error humano a través de la automatización, Flow-FISH es caro, menos eficiente y requiere muestras frescas y un técnico altamente cualificado, limitando su capacidad para estudios epidemiológicos 16 . Además, este método no tiene en cuenta los posibles cambios en el número de cromosomas en la población celular. Otra técnica, qPCR, es ampliamente aceptada como un medio para medir la longitud de los telómeros para estudios epidemiológicos <suP class = "xref"> 16 debido a su alto rendimiento, bajo costo y el requisito de pequeñas cantidades de ADN en comparación con otros métodos. Sin embargo, qPCR sólo puede medir el contenido medio de telómeros de ADN en relación con un único gen de copia y es, por lo tanto, una estimación indirecta de la longitud promedio telómero. También produce un alto coeficiente de varianza en los estudios de comparación, en comparación con Southern blots, lo que conduce a la precisión cuestionable [ 21] .
El procedimiento de TRF tiene sus propias deficiencias que limitan su uso para algunos estudios. Las técnicas de TRF requieren una gran cantidad de ADN en comparación con otros métodos (entre 2 y 3 μg por muestra). Esto limita las aplicaciones de la técnica al examen de la longitud de telómeros de las muestras clínicas para las que se puede recoger ADN genómico suficiente y no puede utilizarse en muestras de ADN degradadas. Además, el análisis de la TRF es costoso y requiere mucha mano de obra, requiriendo 4-5 días para obtener resultados. Sin embargo, el TRF produce un bajo coeficiente de varianzaConcediendo su reproducibilidad. Aunque este protocolo es diferente del tradicional Southern blot (utilizando la hibridación en gel di situ), las dos técnicas son fundamentalmente las mismas.
La técnica presentada aquí es una combinación de una transferencia de Southern y hibridación en gel; Asociando el paso de desnaturalización del ADN de las transferencias de Southern con la hibridación en gel. Esta combinación tiene el beneficio añadido de una intensidad de señal de sonda mejorada en comparación con la transferencia de Southern y ha proporcionado consistentemente resultados cuantificables dentro de nuestro laboratorio. Además, el uso de sondas radiactivas en lugar de sondas quimioluminiscentes produce una intensidad de señal más alta y permite la visualización y cuantificación con un fosforoimager, haciendo que los análisis de la TRF sean fáciles de usar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Después de la electroforesis, el frotis de ADN genómico es superior a 800 pb. Esto puede ocurrir si las enzimas de restricción son defectuosas o si se necesitan enzimas adicionales (como se ha descrito anteriormente). Una segunda explicación posible es que la proteína todavía está unida al ADN. Cuando se determina la concentración de ADN por espectrofotómetro, la relación 260/280 debe ser de alrededor de 1,8. Si esta proporción es <1,5, hay contaminación de proteínas que puede interferir con la digestió…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen el apoyo de la Universidad de Pittsburgh Cancer Institute Biobehavioral Oncología instalación compartida que es apoyado en parte por el premio P30CA047904.
Materials
| Biologics | |||
| Rsa1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0167S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Hinf1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0155S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | electrophoresis grade agarose |
| Optikinase | affymetrix | 78334X 500 UN | T4 Polynucleotide Kinase |
| SYBR Green Nucleic Acid Stain I | ThermoFisher Scientific | S7567 | Syber Green |
| exactGene DNA Ladder 24- kB | Fisher Scientific | BP2580100 | |
| C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5) | Integrated DNA Technologies | Custom ordered DNA oligonucleotide | |
| Gamma-ATP-P32 | Perkin Elmer | BLU502Z | Radioisotope |
| Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit | Qiagen | 13323 | DNA extraction kit |
| GE Illustra Microspin G-25 column | GE Healthcare Life Sciences | 27-5325-01 | For purification of readioactive oligo probe |
| Ficoll 400 | non-ionic synthetic polymer | ||
| Equipment/Software | |||
| Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm) | ThermoFisher Scientific | A5 | Gel electrophoresis |
| Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm) | Corel Life Sciences | 11068020 | Gel electrophoresis |
| Nylon mesh, 50, 12" x 12" | Ted Pellam, Inc | 41-12105 | |
| GE Storage Phosphor Screens | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-75 | |
| Phosphor Screen Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | 63-0035-44 | |
| Isotemp Hybridzation Incubator | Fisher Scientific | 13-247-20Q | |
| Cylindrical hybridization tubes | Fisher Scientific | 13-247-300 | |
| The Belly Dancer orbital shaker | Sigma-aldrich | Z768499-1EA | Orbital shaker |
| Typhoon 9400 | ABI | For imaging of gels and phosphor screens | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad | Version 6.05 | Graphing Program |
| Microsoft Excel | Microsoft | Office 365 | Spreadsheet program |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrp 2000 | Spectrophotometer |
Riferimenti
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