Modifierad terminalbegränsningsfragmentanalys för kvantifiering av telomerlängd med användning av in-gel-hybridisering
Summary
I denna artikel diskuteras ett detaljerat protokoll för kvantifiering av telomerlängden med hjälp av en modifierad terminalrestriktionsfragmentanalys som ger snabb och effektiv direktmätning av telomerlängden. Denna teknik kan appliceras på en mängd olika cellkällor för DNA för att kvantifiera telomerlängden.
Abstract
Det finns flera olika tekniker för mätning av telomerlängden, var och en med sina egna fördelar och nackdelar. Det traditionella tillvägagångssättet, Telomere Restriction Fragment (TRF) -analys, utnyttjar en DNA-hybridiseringsteknik där genomiska DNA-prover digereras med restriktionsenzymer och lämnar bakom telomer-DNA-upprepningar och något subtelomer-DNA. Dessa separeras genom agarosgelelektrofores, överföres till ett filtermembran och hybridiseras till oligonukleotidprober märkta med antingen kemiluminescens eller radioaktivitet för att visualisera telomer-restriktionsfragment. Detta tillvägagångssätt, medan det krävs en större mängd DNA än andra tekniker, såsom PCR, kan mäta telomerlängdsfördelningen av en population av celler och tillåter mätning uttryckt i absoluta kilobaser. Detta manuskript demonstrerar en modifierad DNA-hybridiseringsprocedur för bestämning av telomerlängden. Genomiskt DNA digereras först med restriktionsenzymer (som inte skärsTelomerer) och separeras genom agarosgelelektrofores. Gelen torkas sedan och DNA-denatureras och hybridiseras in situ till en radioaktivt märkt oligonukleotidprobe. Denna in situ hybridisering undviker förlust av telomer-DNA och förbättrar signalintensiteten. Efter hybridisering avbildas gelerna med användning av fosforskärmar och telomerlängden kvantifieras med användning av ett grafprogram. Denna procedur har utvecklats av laboratorierna i Drs. Woodring Wright och Jerry Shay vid University of Texas Southwestern 1 , 2 . Här presenterar vi en detaljerad beskrivning av detta förfarande, med några ändringar.
Introduction
Telomerer, som ligger vid ändarna av kromosomer, är nukleotidrepetitioner av sekvensen TTAGGG (på mänskliga kromosomer) som spelar en kritisk roll för att skydda cellegenetisk information 3 , 4 , 5 . Telomerer är flera tusen baspar i längd och tjänar till att skydda integriteten hos resten av kromosomen under DNA-replikation. Reprovering av kromosomer är inte perfekt vilket resulterar i att kromosomändarna inte kopieras fullständigt. Denna ineffektivitet vid replikering benämns "end replikationsproblemet" och resulterar i förlust av några av telomereupprepningarna under varje omgång av replikering 6 , 7 . Telomerlängden kan återställas efter celldelning med telomeras, ett enzym som ersätter de förlorade telomersekvenserna 8 , 9 . Telomeras är dock inteAktiveras i de flesta mänskliga somatiska celler och som ett resultat kommer telomerer över tiden att förkorta, så småningom resultera i cellulär senescens 10 . På grund av telomererförkortning betraktas telomerer som en biomarkör av åldrande och risk för åldersrelaterade sjukdomar 11 , 12 . Dessutom kan telomerlängden påverkas av genetiska, miljömässiga och livsstilsfaktorer och andra stimuli som oxidativ stress, vilket indikerar att telomerlängden kan spela en roll som biomarkör i toxikologiska, epidemiologiska och beteendestudier 13 , 14 , 15 .
Denna artikel visar en teknik för att mäta telomerlängden med användning av en modifierad terminal-restriktionsfragment (TRF) -analys anpassad från Mender and Shay 2 och Kimura et al. 16 , och liknar Herbert, Shay och WrigHt 1 och haussmann och Mauck 17 Traditionellt innebär TRF-analys en Southern blot-procedur. Southern blots anses vara "guldstandarden" för att studera telomerlängden och används aktivt för undersökning av leukocyttelomererlängd i epidemiologiska studier 18 . Denna TRF-analys använder digererat genomiskt DNA som lämnar bakom telomereupprepningarna. DNA-fragmenten separeras sedan genom gelelektrofores, denatureras och överförs till ett nitrocellulosamembran. Telomer-sekvenserna hybridiseras till en telomer-oligonukleotidsond. I stället för att överföra de separerade telomererna till ett membran använder andra TRF-tekniker in-gel-hybridiseringstekniker med och utan denaturering av DNA. Inkluderingen av denaturering är viktig när man beaktar detektion av interstitiella telomerer, vilka har rapporterats hos vissa arter 19 . Förfaranden som saknar denatureringssteg upptäcker bara thE enkelsträngad DNA-överhängning vid terminala telomerer och kommer inte binda till interstitiella telomersekvenser 18 .
Förutom TRF-analys finns det flera andra tekniker för mätning av telomerlängden som var och en har sina egna fördelar och nackdelar. Flow-FISH-tekniken kan mäta genomsnittlig telomerlängd av individuella celler av en distinkt celltyp med användning av flödescytometri 16 , 20 . Medan det med säkerhet kan märka telomerer med mycket specifika sonder och minska mänskligt fel genom automatisering, är Flow-FISH dyrt, mindre effektivt och kräver färska prover och en högkvalificerad tekniker som begränsar sin förmåga till epidemiologiska studier 16 . Dessutom står denna metod inte för potentiella förändringar i antalet kromosomer i cellpopulationen. En annan teknik, qPCR, är allmänt accepterad som ett sätt att mäta telomerlängden för epidemiologiska studier <suP class = "xref"> 16 på grund av sin höga genomströmning, låg kostnad och krav på små mängder DNA jämfört med andra metoder. QPCR kan emellertid endast mäta genomsnittligt telomeriskt DNA-innehåll i förhållande till en enkelkopieringsgen och är således en indirekt uppskattning av genomsnittlig telomerlängd. Det ger också en hög variationskoefficient i jämförelsestudier jämfört med sydliga blottningar, vilket leder till tveksamt noggrannhet 21 .
TRF-förfarandet har sina egna brister som begränsar användningen för vissa studier. TRF-tekniker kräver en stor mängd DNA jämfört med andra metoder (mellan 2 och 3 μg per prov). Detta begränsar teknikens tillämpningar för att undersöka telomerlängden av kliniska prover för vilka tillräckligt genomiskt DNA kan samlas och kan inte användas på nedbrytna DNA-prover. Dessutom är TRF-analysen dyr och arbetsintensiv, vilket kräver 4-5 dagar för att ge resultat. TRF ger emellertid en låg variationskoefficientGer reproducerbarhet. Även om detta protokoll är annorlunda än det traditionella Southern blot (utnyttjande in situ gel hybridisering), är de båda teknikerna i grunden samma.
Tekniken som presenteras här är en kombination av en Southern blot och in-gel hybridisering; Associering av DNA-denatureringssteget från sydliga blottar med in-gel-hybridiseringen. Denna kombination har den extra fördelen med förbättrad sond signalstyrka jämfört med Southern blot och har konsekvent givit kvantifierbara resultat inom vårt laboratorium. Dessutom ger användningen av radioaktiva sonder snarare än kemiluminescerande sonder högre signalintensitet och möjliggör visualisering och kvantifiering med en fosforbildare, vilket gör analyserna av användarvänliga TRF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Efter elektrofores är den genomiska DNA-smeten högre än 800 bp. Detta kan inträffa om restriktionsenzymerna är defekta eller om ytterligare enzymer (som beskrivna ovan) behövs. En andra möjlig förklaring är att proteinet fortfarande är fäst vid DNA: n. Vid bestämning av DNA-koncentrationen genom spektrofotometer bör 260/280 förhållandet vara omkring 1,8. Om detta förhållande är <1,5, är det proteinförorening som kan störa restriktionsenzym digestion. Antingen skulle DNA-provet behöva isoleras ig…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna bekräftar stöd från University of Pittsburgh Cancer Institute Biobehavioral Oncology delad anläggning som delvis stöds genom utmärkelse P30CA047904.
Materials
| Biologics | |||
| Rsa1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0167S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Hinf1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0155S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | electrophoresis grade agarose |
| Optikinase | affymetrix | 78334X 500 UN | T4 Polynucleotide Kinase |
| SYBR Green Nucleic Acid Stain I | ThermoFisher Scientific | S7567 | Syber Green |
| exactGene DNA Ladder 24- kB | Fisher Scientific | BP2580100 | |
| C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5) | Integrated DNA Technologies | Custom ordered DNA oligonucleotide | |
| Gamma-ATP-P32 | Perkin Elmer | BLU502Z | Radioisotope |
| Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit | Qiagen | 13323 | DNA extraction kit |
| GE Illustra Microspin G-25 column | GE Healthcare Life Sciences | 27-5325-01 | For purification of readioactive oligo probe |
| Ficoll 400 | non-ionic synthetic polymer | ||
| Equipment/Software | |||
| Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm) | ThermoFisher Scientific | A5 | Gel electrophoresis |
| Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm) | Corel Life Sciences | 11068020 | Gel electrophoresis |
| Nylon mesh, 50, 12" x 12" | Ted Pellam, Inc | 41-12105 | |
| GE Storage Phosphor Screens | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-75 | |
| Phosphor Screen Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | 63-0035-44 | |
| Isotemp Hybridzation Incubator | Fisher Scientific | 13-247-20Q | |
| Cylindrical hybridization tubes | Fisher Scientific | 13-247-300 | |
| The Belly Dancer orbital shaker | Sigma-aldrich | Z768499-1EA | Orbital shaker |
| Typhoon 9400 | ABI | For imaging of gels and phosphor screens | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad | Version 6.05 | Graphing Program |
| Microsoft Excel | Microsoft | Office 365 | Spreadsheet program |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrp 2000 | Spectrophotometer |
Riferimenti
- Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. Analysis of telomeres and telomerase. Curr Protoc Cell Biol. , 16 (2003).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis. Bio Protoc. 5 (22), (2015).
- Blackburn, E. H. Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).
- Greider, C. W. Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).
- Szostak, J. W. DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).
- Watson, J. M., Riha, K. Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah – A Mini-Review. Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).
- Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M. Telomeres-Structure, Function, and Regulation. Exp Cell Res. 319 (2), 133-141 (2013).
- MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. Telomerase Regulation from Beginning to the End. Genes (Basel). 7 (9), 64 (2016).
- Fouquerel, E., Opresko, P. Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair. Photochem Photobiol. , (2016).
- Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence. Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).
- Opresko, P. L., Shay, J. W. Telomere-Associated Aging Disorders. Ageing Res Rev. , 1568-1637 (2016).
- Chiodi, I., Mondello, C. Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).
- Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
- Lindqvist, D., et al. Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging. Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).
- Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M. Telomeres in Molecular Epidemiology Studies. Prog Mol Biol Transl Sci. 125 (113), (2014).
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Haussmann, M. F., Mauck, R. A. TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation. Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).
- Nussey, D. H., et al. Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology. Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).
- Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening. Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).
- Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH). Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).
- Sanders, J. L., Newman, A. B. Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither. Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).
- Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts. Nat Commun. 6, 8214 (2015).
