Modifizierte terminale Restriktionsfragmentanalyse zur Quantifizierung der Telomerenlänge mittels In-Gel-Hybridisierung
Summary
In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung der Telomerlänge unter Verwendung einer modifizierten terminalen Restriktionsfragmentanalyse diskutiert, die eine schnelle und effiziente direkte Messung der Telomerlänge ermöglicht. Diese Technik kann auf eine Vielzahl von Zellquellen von DNA zur Quantifizierung der Telomerlänge angewendet werden.
Abstract
Es gibt mehrere verschiedene Techniken zur Messung der Telomerlänge, jeweils mit ihren eigenen Vor- und Nachteilen. Der traditionelle Ansatz, Telomere Restriction Fragment (TRF) -Analyse, nutzt eine DNA-Hybridisierungsmethode, bei der genomische DNA-Proben mit Restriktionsenzymen verdaut werden, wobei Telomere-DNA-Repeats und einige sub-telomere DNA zurückbleiben. Diese werden durch Agarose-Gelelektrophorese getrennt, auf eine Filtermembran übertragen und an Oligonukleotidsonden hybridisiert, die entweder mit Chemilumineszenz oder Radioaktivität markiert sind, um Telomer-Restriktionsfragmente zu visualisieren. Dieser Ansatz, während er eine größere Menge an DNA benötigt als andere Techniken wie PCR, kann die Telomerlängenverteilung einer Population von Zellen messen und ermöglicht die Messung in absoluten Kilobasen. Dieses Manuskript zeigt ein modifiziertes DNA-Hybridisierungsverfahren zur Bestimmung der Telomerlänge. Genomische DNA wird zuerst mit Restriktionsenzymen verdaut (die nicht schneidenTelomere) und durch Agarose-Gelelektrophorese getrennt. Das Gel wird dann getrocknet und die DNA wird denaturiert und in situ zu einer radioaktiv markierten Oligonukleotidsonde hybridisiert. Diese in situ Hybridisierung vermeidet den Verlust von Telomere DNA und verbessert die Signalintensität. Nach der Hybridisierung werden die Gele unter Verwendung von Leuchtstoffschirmen abgebildet und die Telomerlänge unter Verwendung eines graphischen Programms quantifiziert. Dieses Verfahren wurde von den Labors von Drs entwickelt. Woodring Wright und Jerry Shay an der University of Texas Southwestern 1 , 2 . Hier stellen wir eine detaillierte Beschreibung dieses Verfahrens vor, mit einigen Modifikationen.
Introduction
Telomere, die sich an den Enden der Chromosomen befinden, sind Nukleotidwiederholungen der Sequenz TTAGGG (auf menschlichen Chromosomen), die eine entscheidende Rolle beim Schutz der zellulären genetischen Information spielen 3 , 4 , 5 . Telomere sind mehrere tausend Basenpaare lang und dienen dazu, die Integrität des Restes des Chromosoms während der DNA-Replikation zu schützen. Die Replikation von Chromosomen ist nicht perfekt, da die Enden des Chromosoms nicht vollständig kopiert wurden. Diese Ineffizienz in der Replikation wird als das "End-Replikationsproblem" bezeichnet und führt zu einem Verlust von einigen der Telomer-Wiederholungen während jeder Replikationsrunde 6 , 7 . Die Telomere-Länge kann nach der Zellteilung durch Telomerase wiederhergestellt werden, ein Enzym, das die verlorenen Telomersequenzen 8 , 9 ersetzt . Telomerase ist aber nichtAktiviert in den meisten menschlichen somatischen Zellen und als Ergebnis, im Laufe der Zeit, werden die Telomere verkürzen, was schließlich zu zellulären Seneszenz 10 führt . Aufgrund der Telomerverkürzung werden Telomere als Biomarker des Alterns und das Risiko altersbedingter Krankheiten angesehen 11 , 12 . Darüber hinaus kann die Telomerlänge durch genetische, ökologische und lebensstilfaktoren und andere stimuli wie oxidativen Stress beeinflusst werden, was darauf hinweist, dass die Telomerlänge als Biomarker in toxikologischen, epidemiologischen und Verhaltensstudien eine Rolle spielen kann 13 , 14 , 15 .
Dieser Artikel zeigt eine Technik zur Messung der Telomerlänge unter Verwendung einer modifizierten terminalen Restriktionsfragment (TRF) -Analyse, die von Mender und Shay 2 und Kimura et al. 16 , und ähnlich wie Herbert, Shay und WrigHt 1 und Haussmann und Mauck 17 . Traditionell beinhaltet die TRF-Analyse ein Southern-Blot-Verfahren. Southern-Blots gelten als "Gold-Standard" für das Studium der Telomer-Länge und werden aktiv zur Untersuchung der Leukozyten-Telomer-Länge in Epidemiologie-Studien verwendet 18 . Diese TRF-Analyse verwendet verdaute genomische DNA, die die Telomer-Wiederholungen hinterlässt. Die DNA-Fragmente werden dann durch Gelelektrophorese getrennt, denaturiert und auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die Telomer-Sequenzen werden an eine Telomere-Oligonukleotidsonde hybridisiert. Anstatt die getrennten Telomere auf eine Membran zu übertragen, verwenden andere TRF-Techniken In-Gel-Hybridisierungstechniken mit und ohne Denaturierung der DNA. Die Einbeziehung der Denaturierung ist bei der Betrachtung des Nachweises von interstitiellen Telomeren, die bei einigen Arten berichtet wurden, wichtig. Prozeduren, die denaturierende Schritte fehlen, erkennen nur thE einzelsträngige DNA-Überhänge an terminalen Telomeren und werden nicht an interstitielle Telomersequenzen 18 binden.
Neben der TRF-Analyse gibt es noch einige andere Techniken zur Messung der Telomerlänge, die jeweils ihre eigenen Vor- und Nachteile haben. Die Flow-FISH-Technik kann die mittlere Telomerlänge einzelner Zellen eines bestimmten Zelltyps mit der Durchflusszytometrie 16 , 20 messen. Während es telomeres mit hochspezifischen Sonden genau markieren und menschliches Fehler durch Automatisierung reduzieren kann, ist Flow-FISH teuer, weniger effizient und erfordert frische Proben und einen hochqualifizierten Techniker, der seine Fähigkeit zur Epidemiologie-Studien einschränkt. Darüber hinaus berücksichtigt diese Methode keine potenziellen Veränderungen der Anzahl der Chromosomen in der Zellpopulation. Eine andere Technik, qPCR, wird weithin als Mittel zur Messung der Telomerlänge für Epidemiologie-Studien akzeptiert <suP class = "xref"> 16 aufgrund seines hohen Durchsatzes, Low-Cost und Anforderung für kleine Mengen an DNA im Vergleich zu anderen Methoden. Jedoch kann qPCR nur den durchschnittlichen telomeren DNA-Gehalt relativ zu einem einzelnen Kopiengen messen und ist somit eine indirekte Schätzung der durchschnittlichen Telomerlänge. Es ergibt auch einen hohen Variationskoeffizienten in Vergleichsstudien, verglichen mit südlichen Blots, was zu fragwürdiger Genauigkeit führt 21 .
Das TRF-Verfahren hat seine eigenen Mängel, die seine Verwendung für einige Studien einschränken. TRF-Techniken erfordern eine große Menge an DNA im Vergleich zu anderen Methoden (zwischen 2 und 3 μg pro Probe). Dies beschränkt die Anwendung der Technik auf die Untersuchung der Telomerlänge von klinischen Proben, für die genügend genomische DNA gesammelt werden kann und nicht auf abgebauten DNA-Proben verwendet werden kann. Darüber hinaus ist die TRF-Analyse kostspielig und arbeitsintensiv und erfordert 4-5 Tage, um Ergebnisse zu erzielen. Die TRF ergibt jedoch einen niedrigen VariationskoeffizientenGewährleistung der Reproduzierbarkeit Während dieses Protokoll anders ist als das traditionelle Southern-Blot (unter Verwendung von In-situ- Gel-Hybridisierung), sind die beiden Techniken grundsätzlich das gleiche.
Die hier vorgestellte Technik ist eine Kombination aus einer Southern-Blot- und In-Gel-Hybridisierung; Assoziieren des DNA-Denaturierungsschrittes von Southern-Blots mit der In-Gel-Hybridisierung. Diese Kombination hat den zusätzlichen Vorteil einer verbesserten Sonden-Signalstärke im Vergleich zum Southern-Blot und hat konsequent quantifizierbare Ergebnisse in unserem Labor ergeben. Darüber hinaus liefert die Verwendung von radioaktiven Sonden anstelle von chemilumineszierenden Sonden eine höhere Signalintensität und ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung mit einem Phosphorimager, wodurch die Analysen der TRF benutzerfreundlich sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nach der Elektrophorese ist der genomische DNA-Abstrich höher als 800 bp. Dies kann auftreten, wenn die Restriktionsenzyme fehlerhaft sind oder wenn zusätzliche Enzyme (wie oben beschrieben) benötigt werden. Eine zweite mögliche Erklärung ist, dass das Protein noch an die DNA gebunden ist. Bei der Bestimmung der DNA-Konzentration durch Spektrophotometer sollte das Verhältnis 260/280 etwa 1,8 betragen. Wenn dieses Verhältnis <1,5 ist, gibt es eine Proteinverunreinigung, die die Restriktionsenzymverdauung störe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bestätigen die Unterstützung der University of Pittsburgh Cancer Institute Biobehavioral Oncology gemeinsame Einrichtung, die teilweise durch Auszeichnung P30CA047904 unterstützt wird.
Materials
| Biologics | |||
| Rsa1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0167S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Hinf1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0155S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | electrophoresis grade agarose |
| Optikinase | affymetrix | 78334X 500 UN | T4 Polynucleotide Kinase |
| SYBR Green Nucleic Acid Stain I | ThermoFisher Scientific | S7567 | Syber Green |
| exactGene DNA Ladder 24- kB | Fisher Scientific | BP2580100 | |
| C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5) | Integrated DNA Technologies | Custom ordered DNA oligonucleotide | |
| Gamma-ATP-P32 | Perkin Elmer | BLU502Z | Radioisotope |
| Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit | Qiagen | 13323 | DNA extraction kit |
| GE Illustra Microspin G-25 column | GE Healthcare Life Sciences | 27-5325-01 | For purification of readioactive oligo probe |
| Ficoll 400 | non-ionic synthetic polymer | ||
| Equipment/Software | |||
| Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm) | ThermoFisher Scientific | A5 | Gel electrophoresis |
| Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm) | Corel Life Sciences | 11068020 | Gel electrophoresis |
| Nylon mesh, 50, 12" x 12" | Ted Pellam, Inc | 41-12105 | |
| GE Storage Phosphor Screens | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-75 | |
| Phosphor Screen Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | 63-0035-44 | |
| Isotemp Hybridzation Incubator | Fisher Scientific | 13-247-20Q | |
| Cylindrical hybridization tubes | Fisher Scientific | 13-247-300 | |
| The Belly Dancer orbital shaker | Sigma-aldrich | Z768499-1EA | Orbital shaker |
| Typhoon 9400 | ABI | For imaging of gels and phosphor screens | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad | Version 6.05 | Graphing Program |
| Microsoft Excel | Microsoft | Office 365 | Spreadsheet program |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrp 2000 | Spectrophotometer |
Riferimenti
- Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. Analysis of telomeres and telomerase. Curr Protoc Cell Biol. , 16 (2003).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis. Bio Protoc. 5 (22), (2015).
- Blackburn, E. H. Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).
- Greider, C. W. Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).
- Szostak, J. W. DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).
- Watson, J. M., Riha, K. Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah – A Mini-Review. Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).
- Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M. Telomeres-Structure, Function, and Regulation. Exp Cell Res. 319 (2), 133-141 (2013).
- MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. Telomerase Regulation from Beginning to the End. Genes (Basel). 7 (9), 64 (2016).
- Fouquerel, E., Opresko, P. Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair. Photochem Photobiol. , (2016).
- Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence. Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).
- Opresko, P. L., Shay, J. W. Telomere-Associated Aging Disorders. Ageing Res Rev. , 1568-1637 (2016).
- Chiodi, I., Mondello, C. Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).
- Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
- Lindqvist, D., et al. Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging. Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).
- Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M. Telomeres in Molecular Epidemiology Studies. Prog Mol Biol Transl Sci. 125 (113), (2014).
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Haussmann, M. F., Mauck, R. A. TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation. Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).
- Nussey, D. H., et al. Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology. Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).
- Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening. Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).
- Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH). Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).
- Sanders, J. L., Newman, A. B. Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither. Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).
- Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts. Nat Commun. 6, 8214 (2015).
