Взаимодействие с мРНК из протопластов растений
Summary
Здесь мы представляем протокол захвата сигналов, примененный к протопластам листьев Arabidopsis thaliana leaf mesophyll. Этот метод критически полагается на ультрафиолетовое сшивание in vivo и позволяет изолировать и идентифицировать растительные мРНК-связывающие белки из физиологической среды.
Abstract
РНК-связывающие белки (RBPs) определяют судьбы РНК. Они участвуют во всех путях биогенеза РНК и особенно вносят свой вклад в посттранскрипционную регуляцию генов (ПГРР) мессианных РНК (мРНК). В последние несколько лет ряд связанных с мРНК протеомами из клеточных линий дрожжей и млекопитающих успешно изолировали с помощью нового метода, называемого «захват млекопитающих мРНК», который позволяет идентифицировать мРНК-связывающие белки (mRBP) Непосредственно из физиологической среды. Метод состоит из ультрафиолетового (УФ) сшивки in vivo , вытягивания и очистки комплексов рибонуклеопротеинов мессенджера (mRNPs) гранулами олиго (dT) и последующей идентификации сшитых белков с помощью масс-спектрометрии (MS). Совсем недавно, применяя тот же метод, сообщалось о нескольких растительных мРНК-связанных протеомах из разных источников ткани Arabidopsis : этиолированные проростки, ткань листьев,Протопласты листьев мезофилла и культивируемые корневые клетки. Здесь мы представляем оптимизированный метод захвата мРНК-методом для протопластов листьев Arabidopsis thaliana leafes, тип клеток, который служит универсальным инструментом для экспериментов, которые включают в себя различные клеточные анализы. Условия для оптимального выхода белка включают количество исходной ткани и продолжительность УФ-облучения. В мРНК-связанном протеоме, полученном из среднемасштабного эксперимента (10 7 клеток), обнаружены RBP, отмеченные наличием РНК-связывающей способности, и были идентифицированы многие новые RBP. Эксперимент может быть увеличен (10 9 клеток), и оптимизированный метод может быть применен к другим типам растительных клеток и видам, чтобы широко изолировать, каталогизировать и сравнивать связанные с мРНК протеомы в растениях.
Introduction
Эукариоты используют множественные регуляторные пути биогенеза РНК для поддержания клеточных биологических процессов. Среди известных типов РНК мРНК очень разнообразна и обладает кодирующей способностью белков и их изоформ 1. Путь ПТРГ направляет судьбы пре-мРНК 2 , 3 . RBP из разных семейств генов контролируют регуляцию РНК, а в PTGR специфические mRBPs направляют мРНК через прямые физические взаимодействия, образуя функциональные mRNP. Таким образом, идентификация и характеристика mRBPs и их mRNPs имеет решающее значение для понимания регуляции метаболизма клеточной мРНК 2. За последние три десятилетия различные методы in vitro, включая анализ сдвига электрофоретической подвижности РНК (REMSA), систематическую эволюцию лигандов с помощью экспоненциальных анализов обогащения (SELEX), основанный на библиотечных конструкциях, RNA Bind-n-Seq (RBNS), радиоактивно меченых или количественныхФлуоресцентные анализы связывания РНК, рентгеновская кристаллография и ЯМР-спектроскопия 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 – широко применяются к исследованиям RBP, главным образом из клеток млекопитающих. Результаты этих исследований RBP млекопитающих можно искать через РНК-связывающую базу данных протеина (RBPDB), которая собирает опубликованные наблюдения 10 .
Хотя эти подходы in vitro являются мощными инструментами, они определяют связанные мотивы РНК из заданного пула последовательностей РНК и поэтому ограничены в их способности обнаруживать новые целевые РНК. То же самое верно и для вычислительных стратегий для прогнозирования генома ОДП, которые основаны на сохранении белковой последовательности и структуры 15. Чтобы преодолеть это, новый экспериментальный метод haЧто позволяет идентифицировать мотивы РНК, с которыми взаимодействует RBP, а также для определения точного местоположения привязки. Этот метод, называемый «сшивка и иммунопреципитация» (CLIP), состоит из ультрафиолетового сшивания in vivo с последующим иммунопреципитацией 11 . Ранние исследования показали, что фотоактивация ДНК и РНК-нуклеотидов может происходить при длинах волн возбуждения УФ-лучей, превышающих 245 нм. Реакция через тимидин, по-видимому, благоприятствует (ранг в порядке уменьшения фотореактивности: dT ≥ dC> rU> rC, dA, dG) 12 . Используя УФ-излучение с длиной волны 254 нм (УФ-С), было обнаружено, что ковалентные связи между нуклеотидами РНК и остатками белка создаются в пределах лишь нескольких ангстрем (Å). Явление, таким образом, называется «нулевой длиной» сшивки РНК и RBP. За этим может следовать строгая процедура очистки Dure с небольшим фоном 13 , 14 .
Стратегия, дополняющая CLIP, заключается в том, чтобы объединить UV-сшивание in vivo с идентификацией белка для описания ландшафта RBP. Ряд таких геномных мРНК-связанных протеомов был выделен из дрожжевых клеток, эмбриональных стволовых клеток (ESCs) и клеточных линий человека ( т.е. HEK293 и HeLa) с использованием этого нового экспериментального подхода, называемого «захват мРНК-взаимодействием» 18 , 19 , 20 , 21 . Метод состоит из ультрафиолетового сшивки in vivo с последующей очисткой mRNP и протеомикой на основе MS. Применяя эту стратегию, было обнаружено много новых «лунных светящихся» RBP, содержащих неканонические RBD, и стало ясно, что больше белков обладает способностью связываться с РНК, чем предполагалось ранее«> 15 , 16 , 17. Использование этого метода позволяет использовать новые приложения и возможность отвечать на новые биологические вопросы при исследовании RBP. Например, недавнее исследование исследовало сохранение связанного с мРНК протеомом (основной RBP Протеом) между клетками дрожжей и человека 22 .
Было обнаружено, что RBP растений уже участвуют в росте и развитии ( например , в посттранскрипционной регуляции времени цветения, циркадных часов и экспрессии генов в митохондриях и хлоропластах) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , Кроме того, предполагается, что они выполняют функции в клеточных процессах, реагирующих на абиотические стрессы ( например, холод, засуха, sa(ABA)) 31 , 32 , 33 , 34 . В геноме Arabidopsis thaliana имеется более 200 предсказанных генов RBP, основанных на мотивах мотивов распознавания РНК (RRM) и K homology (KH); В рисе было отмечено около 250 35 , 36 . Примечательно, что многие предсказанные ОСП, по-видимому, уникальны для растений ( например, не ортологий метазоанов примерно до 50% предсказанных ОКРБ Arabidopsis, содержащих домен RRM) 35 , предполагая, что многие могут выполнять новые функции. Функции большинства прогнозируемых ОДП остаются нехарактерными 23 .
Выделение мРНК-связанных протеомов из этиолированных проростков Arabidopsis , листовой ткани, культивируемых корневых клеток и протопластов листьев мезофилла посредством использованияНедавно был зарегистрирован захват мРНК-взаимодействием 38 , 39 . Эти исследования демонстрируют сильный потенциал систематической каталогизации функциональных RBP на заводах в ближайшем будущем. Здесь мы представляем протокол для захвата мРНК-захвата из протопластов растений ( т. Е. Клеток без клеточных стенок). Протопласты мезофилла листа Arabidopsis thaliana являются основным типом листовых клеток. Изолированные протопласты обеспечивают оптимальный доступ к ультрафиолетовому излучению. Этот тип клеток можно использовать в анализах, которые временно экспрессируют белки для функциональной характеристики 40 , 41 . Кроме того, протопластика была применена к нескольким другим типам растительных клеток и видам 42 , 43 , 44 ( например, Petersson et al ., 2009; Bargmann and Birnbaum, 2010; Hong и др ., 2012).
<P class = "jove_content"> Метод включает в общей сложности 11 шагов ( рисунок 1A ). Сначала собирают протопласты листьев Arabidopsis (этап 1) и затем подвергают ультрафиолетовому облучению с образованием сшитых mRNP (стадия 2). Когда протопласты лизируют в условиях денатурации (этап 3), сшитые mRNPs высвобождаются в буфере для лизиса / связывания и вытягиваются бусинами олиго-d (T) 25 (этап 4). После нескольких раундов строгих промывок mRNP очищают и далее анализируют. Денатурированные пептиды mRBPs расщепляются протеиназой K до того, как сшитые мРНК очищаются и качество РНК проверяется qRT-PCR (этапы 5 и 6). После обработки РНКазой и концентрации белка (стадия 7) качество белка контролируется электрофорезом на основе полиакриламидного геля SDS (SDS-PAGE) и окрашиванием серебром (этап 8). Различие в структурах полос белка может быть легко визуализировано между сшитым образцом (CL) и несшитым образцом (не-CL;Отрицательный контрольный образец из протопластов, который не подвергается УФ-облучению). Идентификация белков достигается с помощью протеомики на основе MS. Белки из образца CL отделяют одномерным электрофорезом на полиакриламидном геле (1D-PAGE) для удаления возможного фонового загрязнения, «расщепляют в геле» в короткие пептиды с использованием трипсина и очищают (этап 9). Нано-фазовая жидкостная хроматография, связанная с масс-спектрометрией (нано-LC-MS), позволяет определять количество определенных белков в мРНК-связанном протеоме (этап 10). Наконец, идентифицированные mRBP характеризуются и каталогизируются с использованием биоинформационного анализа (этап 11).Protocol
Representative Results
Discussion
Мы успешно применили захват мРНК-взаимодействий, разработанный для дрожжей и человеческих клеток, для протопластов листьев мезофилла. Листовые мезофильные клетки являются основным типом молочной ткани листьев растений. Основным преимуществом этого метода является то, что он использ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем лабораторию профессора Джориса Уиндикера, который предоставил УФ-сшивающее устройство, оснащенное обычной УФ-лампой. KG поддерживается исследовательским фондом KU Leuven и подтверждает поддержку гранта FWO G065713N.
Materials
| REAGENTS | |||
| 0.8 M Mannitol | Sigma | M1902-500G | Primary isotonic Enzyme solution & MMg solution |
| 2M KCl | MERCK | Art. 4935 | Primary isotonic Enzyme solution & W5 buffer |
| 0.2 M MES (pH 5.7) (4-morpholineethanesulfonic acid) |
Sigma-aldrich | M2933 | Primary isotonic Enzyme solution, W5 buffer & MMg solution, Filtration sterilization |
| Cellulase R10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | CELLULASE “ONOZUKA” R-10, 10 g |
Final isotonic enzyme solution |
| Macerozyme R10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | MACEROZYME R-10, 10g | Final isotonic enzyme solution |
| 10% (w/v) BSA (Bovine Serum Albumin) |
Sigma-aldrich | A7906-100G | Final isotonic enzyme solution & Filtration sterilization |
| 1M CaCl2 | Chem-Lab NV | CL00.0317.1000 | Final isotonic enzyme solution, W5 buffer & Digestion buffer |
| 1M NaCl | Fisher Chemical | S/3160/60 | W5 buffer |
| 2M MgCl2 | Sigma | M8266-100G | MMg solution |
| 1M LiCl (Lithium Chloride) |
Acros | 199885000 | Lysis/binding buffer, Wash buffer 1, Wash buffer 2 & Low salt buffer |
| 5% (w/v) LiDS (Lithium Dodecyl Sulphate) |
Sigma-aldrich | L4632-25G | Lysis/binding buffer, Wash buffer 1 & Filtration sterilization |
| 1M DTT (Dithiothreitol) |
Thermo Fisher Scientific Wash buffer 1 & Wash buffer 2 |
307866 | Lysis/binding buffer, |
| 1M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl)) | Acros & Fisher Chemical |
167620010 & H/1200/PB15 |
Lysis/binding buffer, Wash buffer 1, Wash buffer 2, Low salt buffer & Elution buffer |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma-aldrich | ED-500G | Lysis/binding buffer, Wash buffer 1, Wash buffer 2, Low salt buffer & Elution buffer |
| Tween 20 | MERCK | 8.22184.0500 | Regeneration of oligo-d(T)25 beads |
| 0.1 M NaOH | VWR PROLABO CHEMICALS | 28244.295 | Regeneration of oligo-d(T)25 beads |
| 1X PBS (pH 7.4) (Phosphate Buffered Saline) containing (NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4) |
Fisher Chemical, MERCK, Sigma-aldrich & SAFC |
S/3160/60, Art. 4935, 71640-250G & 60230 |
Regeneration of oligo-d(T)25 beads |
| Proteinase K solution (2 μg/μL) | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Protein digestion |
| Loading dye | Invitrogen | LC5925 | SDS-PAGE |
| qPCR master mix | Promega | A6001 | qRT-PCR assay |
| RNase Cocktail | Thermo Fisher Scientific | AM2286 | RNA digestion |
| Methanol | Sigma-aldrich | 322415 | Gel fixation and gel destaining |
| Acetic acid | Sigma-aldrich | 537020 | Gel fixation and gel destaining |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Thermo Fisher Scientific | 20278 | Gel staining |
| 1M NH4HCO3 (Ammonium bicarbonate) |
Sigma-aldrich | 09830-500G | Gel hydration & Digestion buffer |
| CH3CN (Acetonitrile) |
Sigma-aldrich | 34851-100ML | Gel dehydration & Peptide dissolving solution |
| IAA (Iodoacetic acid) |
Sigma-aldrich | I4386-10G | Alkylating agent |
| TFA (Trifluoroacetic acid) |
Sigma-aldrich | 302031-10X1ML | Peptide dissolving solution |
| FA (Formic acid) |
Sigma-aldrich | 06554-5G | Peptide extraction |
| Trypsin solution (6 ng/μL) | Promega | V5280 | Digestion buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Soil | Peltracom | LP2D | Plant growth |
| Vermiculite 3 | Sibli AS | 05VERMICULIET | Plant growth |
| Petri dish (150 x 20 mm) | Sarstedt | 82.1184.500 | Carrier for protoplast suspension |
| 0.22 μm filter | Millipore | SE2M229104 | Homogenization of final isotonic enzyme solution |
| Razorblade | Agar Scientific | T585 | Rosette leaf strips |
| 35-75 μm nylon mesh | SEFAR NITEX | 74010 | Protoplast suspension filtration |
| 50 mL round bottom tubes | Sigma-aldrich | T1918-10EA | Carrier for protoplast suspension |
| Hemocytometer (Bürker hemocytometer) |
MARIENFELD | 650030 | Protoplast cell counting |
| UV crosslinking apparatus (HL-2000 HybriLinker) |
UVP, LLC | UVP95003101 | in vivo UV crosslinking |
| UV lamp (Sankyo-Denki G8T5) |
SANKYO DENKI |
SD G8T5 | in vivo UV crosslinking |
| 50 mL glass syringe | FORTUNA Optima | Z314560 | Homogenization of protoplast lysate |
| Narrow needle (0.9 x 25 mm) | Becton Dickinson microlance 3 | 2021-04 | Homogenization of protoplast lysate |
| Rotator Model L26 | Labinco BV | 26110912 | Sample incubation by rotating |
| Oligo-d(T)25 magnetic beads (5 mg/mL) |
New England BioLabs | S1419S | mRNPs and mRNAs binding and pull-down |
| Magnetic rack | Invitrogen | CS15000 | mRNPs and mRNAs binding and pull-down |
| Centrifugal filter units (Amicon Ultra-4 centrifugal filter units) |
EMD Millipore | UFC800308 | mRBP concentration |
| Pierce Silver Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | 24612 | Silver-staining assay |
| RNA purification kit (InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit) |
STRATEC Molecular | 1064100300 | RNA purification |
| Spectrophotometer device (NanoDrop 1000 Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | RNA quality and quantity |
| Real-Time PCR cycler (StepOne Real-Time PCR cycler) |
Thermo Fisher Scientific | 4376600 | cDNA quantification |
| µ-C18 columns (Millipore Zip Tip µ-C18 columns) |
Sigma-aldrich | 720046-960EA | Peptide purification |
| Mass spectrometer (Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer) |
Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | Mass spectrometry-based proteomics |
| Liquid chromatography instrument (Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) instrument) | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | Mass spectrometry-based proteomics |
| C18 column (Easy Spray Pepmap RSLC C18 column) |
Thermo Fisher Scientific | ES800 | Mass spectrometry-based proteomics |
| C18 precolumn (Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn) |
Thermo Fisher Scientific | 160321 | Mass spectrometry-based proteomics |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers for qRT-PCR assay | Sequences | ||
| UBQ10 mRNA (Li et al., 2014) |
Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA |
||
| 18S rRNA (Durut et al., 2014) |
Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG Rv: CACGACCCGGCCAATTA |
||
Riferimenti
- Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 533-544 (2015).
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15 (12), 829-845 (2014).
- Lin, Q., Taylor, S. J., Shalloway, D. Specificity and determinants of Sam68 RNA binding. Implications for the biological function of K homology domains. J Biol Chem. 272 (43), 27274-27280 (1997).
- Deo, R. C., Bonanno, J. B., Sonenberg, N., Burley, S. K. Recognition of polyadenylate RNA by the poly(A)-binding protein. Cell. 98 (6), 835-845 (1999).
- Kattapuram, T., Yang, S., Maki, J. L., Stone, J. R. Protein kinase CK1 alpha regulates mRNA binding by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein c in response to physiologic levels of hydrogen peroxide. J Biol Chem. 280 (15), 15340-15347 (2005).
- Patel, G. P., Ma, S., Bag, J. The autoregulatory translational control element of poly(A)-binding protein mRNA forms a heteromeric ribonucleoprotein complex. Nucleic Acids Res. 33 (22), 7074-7089 (2005).
- Song, J. K., McGivern, J. V., Nichols, K. W., Markley, J. L., Sheets, M. D. Structural basis for RNA recognition by a type II poly(A)-binding protein. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (40), 15317-15322 (2008).
- Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Mol Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
- Cook, K. B., Kazan, H., Zuberi, K., Morris, Q., Hughes, T. R. RBPDB: a database of RNA-binding specificities. Nucleic Acids Res. 39, D301-D308 (2011).
- Konig, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13 (2), 77-83 (2012).
- Hockensmith, J. W., Kubasek, W. L., Vorachek, W. R., von Hippel, P. H. Laser cross-linking of nucleic acids to proteins. Methodology and first applications to the phage T4 DNA replication system. J Biol Chem. 261 (8), 3512-3518 (1986).
- Pashev, I. G., Dimitrov, S. I., Angelov, D. Crosslinking proteins to nucleic acids by ultraviolet laser irradiation. Trends Biochem Sci. 16 (9), 323-326 (1991).
- Castello, A., et al. System-wide identification of RNA-binding proteins by interactome capture. Nat Protoc. 8 (3), 491-500 (2013).
- Nagy, E., Rigby, W. F. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase selectively binds AU-rich RNA in the NAD(+)-binding region (Rossmann fold). J Biol Chem. 270 (6), 2755-2763 (1995).
- Hentze, M. W., Preiss, T. The REM phase of gene regulation. Trends Biochem Sci. 35 (8), 423-426 (2010).
- Nicholls, C., Li, H., Liu, J. P. GAPDH: a common enzyme with uncommon functions. Clin Exp Pharmacol Physiol. 39 (8), 674-679 (2012).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Castello, A., et al. Insights into RNA Biology from an Atlas of Mammalian mRNA-Binding Proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).
- Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 127-133 (2013).
- Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat Commun. 6 (10127), 1-9 (2015).
- Bailey-Serres, J., Sorenson, R., Juntawong, P. Getting the message across: cytoplasmic ribonucleoprotein complexes. Trends Plant Sci. 14 (8), 443-453 (2009).
- Quesada, V., Macknight, R., Dean, C., Simpson, G. G. Autoregulation of FCA pre-mRNA processing controls Arabidopsis flowering time. EMBO J. 22 (12), 3142-3152 (2003).
- Lim, M. H., et al. A new Arabidopsis gene, FLK, encodes an RNA binding protein with K homology motifs and regulates flowering time via FLOWERING LOCUS C. Plant Cell. 16 (3), 731-740 (2004).
- Hornyik, C., Terzi, L. C., Simpson, G. G. The spen family protein FPA controls alternative cleavage and polyadenylation of RNA. Dev Cell. 18 (2), 203-213 (2010).
- Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annu Rev Plant Biol. 61, 125-155 (2010).
- Schmal, C., Reimann, P., Staiger, D. A circadian clock-regulated toggle switch explains AtGRP7 and AtGRP8 oscillations in Arabidopsis thaliana. PLoS Comput Biol. 9 (3), e1002986 (2013).
- Staiger, D. RNA-binding proteins and circadian rhythms in Arabidopsis thaliana. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356 (1415), 1755-1759 (2001).
- Fischer, B., et al. NovoHMM: a hidden Markov model for de novo peptide sequencing. Anal Chem. 77 (22), 7265-7273 (2005).
- Kwak, K. J., Kim, Y. O., Kang, H. Characterization of transgenic Arabidopsis plants overexpressing GR-RBP4 under high salinity, dehydration, or cold stress. J Exp Bot. 56 (421), 3007-3016 (2005).
- Raab, S., Toth, Z., de Groot, C., Stamminger, T., Hoth, S. ABA-responsive RNA-binding proteins are involved in chloroplast and stromule function in Arabidopsis seedlings. Planta. 224 (4), 900-914 (2006).
- Liu, H. H., et al. Molecular cloning and characterization of a salinity stress-induced gene encoding DEAD-box helicase from the halophyte Apocynum venetum. J Exp Bot. 59 (3), 633-644 (2008).
- Wang, S. C., Liang, D., Shi, S. G., Ma, F. W., Shu, H. R., Wang, R. C. Isolation and Characterization of a Novel Drought Responsive Gene Encoding a Glycine-rich RNA-binding Protein in Malus prunifolia (Willd.) Borkh. Plant Mol Biol Report. 29 (1), 125-134 (2011).
- Lorkovic, Z. J., Barta, A. Genome analysis: RNA recognition motif (RRM) and K homology (KH) domain RNA-binding proteins from the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Res. 30 (3), 623-635 (2002).
- Ambrosone, A., Costa, A., Leone, A., Grillo, S. Beyond transcription: RNA-binding proteins as emerging regulators of plant response to environmental constraints. Plant Science. 182, 12-18 (2012).
- Frank, A., Pevzner, P. PepNovo: de novo peptide sequencing via probabilistic network modeling. Anal Chem. 77 (4), 964-973 (2005).
- Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Sci Rep. 6 (29766), 1-13 (2016).
- Reichel, M., et al. In Planta Determination of the mRNA-Binding Proteome of Arabidopsis Etiolated Seedlings. Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Niu, Y., Sheen, J. Transient expression assays for quantifying signaling output. Methods Mol Biol. 876, 195-206 (2012).
- Petersson, S. V., et al. An auxin gradient and maximum in the Arabidopsis root apex shown by high-resolution cell-specific analysis of IAA distribution and synthesis. Plant Cell. 21 (6), 1659-1668 (2009).
- Bargmann, B. O., Birnbaum, K. D. Fluorescence activated cell sorting of plant protoplasts. J Vis Exp. (36), (2010).
- Hong, S. Y., Seo, P. J., Cho, S. H., Park, C. M. Preparation of Leaf Mesophyll Protoplasts for Transient Gene Expression in Brachypodium distachyon. J Plant Biol. 55 (5), 390-397 (2012).
- Li, Y., Van den Ende, W., Rolland, F. Sucrose Induction of Anthocyanin Biosynthesis Is Mediated by DELLA. Mol Plant. 7 (3), 570-572 (2014).
- Durut, N., et al. A duplicated NUCLEOLIN gene with antagonistic activity is required for chromatin organization of silent 45S rDNA in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (3), 1330-1344 (2014).
- Han, Y. H., Ma, B., Zhang, K. Z. SPIDER: Software for protein identification from sequence tags with De Novo sequencing error. J Bioinform Comput Biol. 3 (3), 697-716 (2005).
- Han, X., He, L., Xin, L., Shan, B., Ma, B. PeaksPTM: Mass spectrometry-based identification of peptides with unspecified modifications. J Proteome Res. 10 (7), 2930-2936 (2011).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Mol Cell Proteomics. 11 (4), 010587 (2012).
- Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12 (42), 1-12 (2016).
- Zhang, Y., et al. Integrative genome-wide analysis reveals HLP1, a novel RNA-binding protein, regulates plant flowering by targeting alternative polyadenylation. CellRes. 25 (7), 864-876 (2015).
- Steen, H., Jensen, O. N. Analysis of protein-nucleic acid interactions by photochemical cross-linking and mass spectrometry. Mass Spec Rev. 21 (3), 163-182 (2002).
- Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol Syst Biol. 7 (458), 1-13 (2011).
- Eng, J., McCormack, A. L., Yates, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. J Am Soc Mass Spectrom. 5 (11), 976-989 (1994).
- Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
