JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Genetica

Høyoppløselig smeltende PCR for komplementreceptor 1 Lengdepolymorfisme Genotyping: Et innovativt verktøy for Alzheimers sykdomssesmerksvurdering

Published: July 18, 2017
doi:
10.3791/56012
, , , ,
1Department of Immunology,Reims University Hospitals, Robert Debré Hospital, 2Faculty of Medicine, LRN EA 4682,University of Reims Champagne-Ardenne, 3Department of Internal Medicine and Geriatrics,Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 4Faculty of Medicine, EA 3797,University of Reims Champagne-Ardenne

Summary

Her beskriver vi en nyskapende metode for å bestemme komplementreceptor 1 (CR1) lengdepolymorfismer til bruk i flere applikasjoner, spesielt vurdering av følsomhet overfor sykdommer som Alzheimers sykdom (AD). Denne metoden kan være nyttig for å bedre forstå rollen av CR1-isoformer i patogenesen av AD.

Abstract

Komplementreceptor 1 (CR1), et transmembran glykoprotein som spiller en nøkkelrolle i det medfødte immunsystemet, uttrykkes på mange celletyper, men spesielt på røde blodlegemer (RBC). Som en reseptor for komplementkomponentene C3b og C4b regulerer CR1 aktiveringen av komplementkaskaden og fremmer fagocytosen av immunkomplekser og cellulær rusk, så vel som amyloid-beta (Ap) peptidet i Alzheimers sykdom (AD). Flere studier har bekreftet AD-assosierte enkelt nukleotidpolymorfier (SNPs), samt en kopi-nummervariasjon (CNV) i CR1- genet. Her beskriver vi en nyskapende metode for å bestemme lengden polymorfisme av CR1-reseptoren. Reseptoren inkluderer tre domener, kalt lange homologe gjentagelser (LHR) -LHR-A, LHR-C og LHR-D- og et n-domene, LHR-B, hvor n er et heltall mellom 0 og 3. Bruke et enkelt par Av spesifikke primere, er det genetiske materialet brukt til å amplifisere et første fragment av LHR-B-domene (thE-variant amplikon B) og et andre fragment av LHR-C-domene (det invariante amplikon). Variant amplikon B og invariant amplikon viser forskjeller ved fem nukleotider utenfor hybridiseringsområdene av nevnte primere. Antallet av variant amplikoner B og av invariant amplikoner er utledet ved hjelp av et kvantitativt verktøy (HRM) med høy oppløsning, og forholdet mellom variant amplikon B og det invariante amplikon varierer i henhold til CR1 lengde polymorfisme. Denne metoden gir flere fordeler i forhold til den kanoniske fenotypemetoden, da det ikke krever nytt materiale og er billigere, raskere og derfor gjeldende for større populasjoner. Bruken av denne metoden bør derfor være nyttig for å bedre forstå rollen av CR1-isoformer i patogenesen av sykdommer som AD.

Introduction

AD, den vanligste årsaken til demens, påvirker mer enn 30 millioner mennesker over hele verden og er et stort folkehelseproblem 1 . Klinisk er AD karakterisert ved neurokognitive forstyrrelser som fører til et progressivt tap av autonomi 2 . AD karakteriseres av to nevropatologiske karakteristikker, nemlig ekstracellulære amyloidavsetninger og intracellulære neurofibrillære tangles 3 .

Tradisjonelt, i henhold til alder av sykdomsbegivenhet, er AD klassifisert i to former. Først er tidlig påbegynt AD (EOAD), hvor oppstart oftest skjer før fylte 65 år; Dette skjemaet utgjør mindre enn 5% av AD-tilfeller. Det er en sjelden, autosomalt dominerende form for AD, som resulterer i fullt penetrerende mutasjoner enten i amyloidprecursorproteinet ( APP) 4 , presenilin 1 ( PSEN1 ) 5 eller presenilin 2 ( PSEN2 )> 6 gener. For det andre kalles den mer vanlige formen av sykdommen (> 90% av AD-tilfellene) "sporadisk" forsinket AD (LOAD) og forekommer oftest hos personer i alderen 65 år eller eldre. Det kommer fra flere genetiske og miljømessige risikofaktorer 7 . I LOAD er 4 allelen av apolipoprotein E ( APOE ) genet den store genetiske risikofaktoren 8 , 9 . Videre er mer enn 20 gen-loci blitt identifisert ved genom-brede assosieringsstudier (GWAS) som å være forbundet med risikoen for AD, hvorav den ene er komplementkomponent (3b / 4b) reseptor 1 ( CR1 ) gen 10 , lokalisert på Kromosom 1q32 i en klynge av komplement-relaterte proteiner. CR1- genet koder for komplement-reseptortype 1 (CR1) protein, en komponent av komplementaktivitetsregulatorene.

CR1 (C3b / C4b reseptoren, CD35), et transmembran glykoprotein tilnærmetEly 200 kDa 11 , binder til C3b, C4b, C3bi, C1q, mannan-bindende lektin (MBL) og ficolin-komplementproteiner 12 . Den biologiske funksjonen til CR1 varierer med celletyper der den uttrykkes. Hos mennesker er 90% av den totale sirkulerende CR1 funnet i røde blodlegemer (RBCs) 13 . Til stede ved overflaten av RBC, binder CR1 til C3b- eller C4b-opsoniserte mikroorganismer eller immunkomplekser, og letter deres klaring fra sirkulasjon. Komplekser bundet til CR1 overføres faktisk til fagocytter når RBC går gjennom leveren og milten 11 , 14 . Ved å begrense avsetningen av C3b og C4b, kan CR1 forhindre overdreven komplementaktivering. Derfor er uttrykket for CR1 på RBCs betraktet som et essensielt element i vern av vev, slik som det cerebrale nervesystemet, mot immunkompleksavsetning og de resulterende sykdommer. CR1 på RBC er også kjent forSpille en viktig rolle i patogen infeksjon 15 , 16 . I tillegg er CR1 som en nøkkelspiller med medfødt immunitet involvert i reguleringen av komplementkaskaden og i transport og klaring av immunkomplekser. CR1 utøver denne aktiviteten ved å binde C3b- og C4b-fragmenter og dissociere klassiske og alternative konverteraser (dissosiasjon av C2a fra C4b2a-komplekset og dissosiasjon av C3b fra C3bBb-komplekset). Som en kofaktor for plasmaserinproteasefaktor I (FI), hemmer CR1 de klassiske og alternative komplementveier ved å øke spaltningen av C4b og C3b ved FI, en egenskap kjent som kofaktoraktivitet (CA), og ved å hemme C3-amplifikasjonssløyfen , Som igjen forhindrer videre komplementaktivering. Rogers og kolleger gir bevis for at Aβ-peptidet kan binde og aktivere komplementveien i fravær av antistoffer 17 og foreslå at Aβ-peptidet er clEared fra sirkulasjon via komplementavhengig adherens til CR1 uttrykt på RBCs 18 .

CR1 utviser tre typer polymorfier: struktur eller lengde polymorfismer, tetthetspolymorfismer og Knops blodgruppe polymorfismer 11 , 19 . Den strukturelle polymorfismen er relatert til en variasjon i antall lange homologe gjentagelser (LHR) og definerer dermed fire isoformer. Faktisk er det ekstracellulære domenet til CR1-proteinet sammensatt av en rekke repeterende enheter, kalt korte konsensusreplater (SCR) eller komplementkontrollrepetater (CCPer). Disse SCR er blitt demonstrert fra komplement-deoksyribonukleinsyren (cDNA) som koder for CR1. SCRene er arrangert i tandemgrupper på syv, kjent som LHRs. CR1 er innrettet i fire LHRer, betegnet som LHR-A, -B, -C og -D, som oppstår ved duplisering av en sju-SCR-enhet 19 , 20 ,21 .

I økende rekkefølge av frekvens er disse CR1-isoformene bestemt av Western blot (WB) CR1 * 1 (A / F) (hurtig migrasjon på gelelektroforese), CR1 * 2 (B / S) (langsom migrasjon på gelelektroforese), CR1 * 3 (C / F`) og CR1 * 4 (D). De to vanligste isoformene, CR1 * 1 (A / F) og CR1 * 2 (B / S), består av henholdsvis fire og fem LHR, mens CR1 * 3 (C / F`) og CR1 * 4 ) Består av henholdsvis 3 og 6 LHR. Den vanligste isoformen (CR1 * 1), bestående av 30 SCR, inneholder tre C4b bindingssteder (SCRs 1-3, 8-10 og 15-17) og to C3b bindingssteder (SCRs 8-10 og 15-17) , Mens SCR 22-28 binder Clq, ficoliner og MBL 12 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 . Således inneholder CR1 * 2 et ytterligere C3b / C4b bindingssted sammenlignetD til CR1 * 1. Figur 1 illustrerer strukturer, nomenklaturer og molekylvekter av de fire forskjellige isoformene til CR1.

Tetthetspolymorfismen tilsvarer en stabil fenotype som representerer nivået av konstitutiv ekspresjon av CR1 på RBCs. I friske kaukasiske emner har det blitt vist at antall CR1 molekyler per RBC kan variere med opptil en faktor på ti (varierende fra 150 til 1200 molekyler per celle) 26 . RBC av Helgeson fenotypen har en svært lav CR1 tetthet, som ble vist å være lavere enn 150 molekyler pr. Celle 27 , 28 . CR1-tettheten på RBC er genetisk forbundet med et autosomalt kodominant biallelisk system på CR1- genet, korrelert med en Hin dIII-restriksjonsfragmentlengdepolymorfisme (RFLP) 29 . En enkeltpunktsmutasjon i Intron 27 av CR1-genet, mellom exonene som koder for det andreSCR i LHR-D, resulterer i dannelsen av et polymorft Hin dIII-sted i dette området 30 . Genomiske Hindlll-fragmenter på 7,4 og 6,9 kDa identifisere alleler forbundet med høye (H-allel) eller lav (L-allel) CR1 tetthet på RBC-er, henholdsvis. Imidlertid ble det ikke funnet noen korrelasjon mellom CR1 tetthet på RBC og Hin dIII polymorfismer i noen vestafrikanske populasjoner 31 , 32 . Mekanismen som forbinder CR1 tetthetsregulering til en ikke-kodende Hin dIII-polymorfisme, er fortsatt ukjent. Blant flere polymorfier har Q981H i SCR16 og P1786R i SCR28 blitt rapportert å være knyttet til CR1 tettheten på RBCs 30 , 33 .

Knops (KN) polymorfismen, ifølge den internasjonale nomenklaturen, er det 22. blodgruppesystemet som skal indekseres av International Society of Blood Transfusion. Den inneholder 9 antigeniske spesiFicities uttrykt av CR1 på RBC, inkludert tre antitetiske antigenpar, KN1 / KN2, KN3 / KN6 og KN4 / KN7, samt 3 isolerte antigener, KN5, KN8, KN9. KN1-, KN3-, KN4- og KN5-antigenene er høyfrekvente antigener av KN-systemet ( dvs. uttrykt i mer enn 99% av den generelle befolkningen). Imidlertid er rollen til denne polymorfismen i AD fortsatt å være bestemt 13 .

Protokollen beskrevet i dette arbeidet ble utformet for å bestemme CR1-lengdepolymorfismens genotyper involvert i mottaglighet for flere sykdommer, som AD, systemisk lupus erythematosus og malaria. Vår metode for bestemmelse av CR1-lengdepolymorfisme utnytter antall LHR-Bs som omfatter CR1-isoformene og av sekvensforskjellene mellom LHR-B og LHR-C ( figur 2 ).

Protocol

Protokollen for innsamling og håndtering av humant blod ble gjennomgått og godkjent av det regionale etiske komiteen (CPP Est II), og protokollnummeret er 2011-A00594-37. MERK: Følgende protokoll beskriver håndtering av humant blod. Vennligst følg institusjonelle retningslinjer ved avhending av biologisk farlig materiale. Laboratoriesikkerhetsutstyr, for eksempel laboratoriejakker og hansker, bør brukes. Et flytskjema som beskriver protokollen vises i figur 3 . 1. Blood and Body Fluid DNA Extraction Pipetten 20 μl proteinase K (15 μg / μl) i bunnen av et 1,5 ml rør. Tilsett 200 μL prøve til 1,5 ml rør. Bruk opp til 200 ul av fullblod, plasma, serum, buffy coat eller kroppsvæsker, eller opp til 5 x 10 6 lymfocytter i 200 ul PBS. Tilsett 200 μl lysisbuffer til prøven. Bland ved puls-vortexing i 15 s. Inkuber ved 56 ° C i 10 minutter i et vannbad. Sentrifuger 1,5 ml røret for å fjerne dråper fra innsiden av lokket. Tilsett 200 μl etanol (96-100%) til prøven og bland igjen ved puls-vortexing i 15 s. Etter blanding, sentrifuger 1,5 ml røret for å fjerne dråper fra innsiden av lokket. Bland forsiktig blandingen fra trinn 1.6 til membranskolonnen (i et 2 ml oppsamlingsrør). Uten å fuke randen, lukk hetten og sentrifuger ved 6000 xg i 1 min. Plasser membrankolonnen i et rent 2 ml oppsamlingsrør og kast røret som inneholder filtratet. Åpne forsiktig membrankolonnen og tilsett 500 μl vaskebuffer 1 uten å fuke randen. Lukk lokket og sentrifuger ved 6000 xg i 1 min. Sett membrankolonnen i et rent 2 ml oppsamlingsrør og kast røret som inneholder filtratet. Åpne forsiktig membrankolonnen og tilsett 500 μl vaskebuffer 2 uten å vaske thE rim. Lukk lokket og sentrifuger med full hastighet (20.000 xg) i 3 min. Plasser membrankolonnen i et nytt 2 ml samlingsrør og kast oppsamlingsrøret med filtratet. Sentrifuger ved 20.000 xg i 1 min. Sett membrankolonnen i et rent 1,5 ml rør og kast oppsamlingsrøret som inneholder filtratet. Åpne forsiktig membrankolonnen og tilsett 200 μl destillert vann. Inkuber ved romtemperatur i 5 minutter og sentrifuger deretter ved 6000 xg i 1 min. Fortsett til bestemmelsen av DNA-konsentrasjonstrinn eller frys DNA-prøvene ved -20 ° C 2. Bestemmelse av DNA-konsentrasjon MERK: Se figur 4 . Trykk 1 for å velge DNA-modus på et spektrofotometer. Velg en lengde på 5 mm med venstre og høyre pil. Velg en fortynningsfaktor på 1 ved hjelp av venstre og høyre pil. Velg enheten (μg / mL) ved hjelp av thE venstre og høyre piler. Velg en faktor på 50 ved hjelp av venstre og høyre pilene. Trykk på OK . Pipet 10 μl destillert vann inn i kuvetten. Sett kuvetten i spektrofotometeret. Trykk på OA / 100% T- knappen. Pipetter 10 μl av DNA-prøven (1/4 fortynning i destillert vann) i kuvetten. Sett kuvetten i spektrofotometeret. Trykk på den grønne knappen (les / start). Merk konsentrasjonen. Frys DNA-prøven ved -20 ° C. 3. HRM-PCR-protokoll Tine DNA-prøvene. Fortynn DNA-prøvene i 1,5 ml rør med vann for å justere dem til en konsentrasjon på 10 ng / μl MERK: Det totale volumet av fortynnet DNA bør være mellom 2 μL og 10 μL. Tine primer-løsningene. Fortynn primerløsningene i 1,5 ml rør med vann for å justere dem til samme konsentrasjon på 6 μM. MERK: Primersekvensene og reaksjonsbetingelsene er gitt i TKan 1. Tabell 1: Primers og parametere som brukes i høyoppløsnings-smelteanalysen. Tør HRM-PCR-kit-løsningene og bland forsiktig ved vortexing for å sikre utvinning av alt innhold. I korthet spinne de tre flaskene som inneholdt den enzymatiske blanding med DNA-bindende fargestoff, MgCl2, og vann i en mikrosentrifuge før åpne dem. Oppbevar dem ved romtemperatur. I et 1,5 ml rør ved romtemperatur, lag PCR-blandingen for en 20 μl reaksjon ved å legge til følgende komponenter i følgende rekkefølge: 10 μl enzymatisk blanding med DNA bindende fargestoff; 2 ul av 25 mM MgCl2; 1 μl primer 1, 6 μM (sluttkonsentrasjon: 300 nM); 1 μl primer 2, 6 μM (sluttkonsentrasjon: 300nM); og 5 μl vann. MERK: For å forberede PCR-blandingen for mer enn én reaksjon, multipliser volumene over ved antall reaksjoner som skal kjøres, pluss en ytterligere reaksjon. Bland forsiktig ved vortexing. Pipett 19 μl PCR-blanding, fremstilt ovenfor, inn i hver brønn i en hvit multiwellplate. Tilsett 1 μl konsentrasjonsjustert DNA-mal, fremstilt i trinn 3.1. MERK: For kontrollreaksjoner må du alltid utføre en negativ kontroll med prøvene. For å forberede en negativ kontroll, erstatt mal-DNA med vann. Tetning den hvite multivellplaten med tetningsfolie. Plasser den hvite multivellplaten i sentrifugen og balanser den med en egnet motvekt ( dvs. en annen multiwellplate). Sentrifuger i 1 min ved 1500 xg i en standard sving-bucket sentrifuge som inneholder en rotor for multiwell plater med passende adaptere. Legg den hvite multivellplaten inn i HRM-PCR-instrumentet. Start HRM-PCR-programmet med følgende PCR-forhold: Denaturering: 95 ° C i 10 minutter; 1 syklus. Forsterkning: 95 ° C i 10 s, 62 ° C i 15s og 72 ° C i 20s; 47 sykluser. Smeltekurve: 95 ° C; Rampehastighet: 0,02 ° C / s; 25 oppkjøp per ° C; 1 syklus. Kjøling: 40 ° C i 30 s; Rampehastighet 2,2 ° C / s; 1 syklus. 4. HRM-analyse for å bestemme CR1-lengdepolymorfismen MERK: Metoden som er beskrevet ( Figur 5 ) er spesifikk for programvaren vår (Se Materialebordet ), selv om andre programvarepakker kan brukes. Åpne en genskanningsprogramvare for å utføre CR1-lengdepolymorfismescaningsanalysen. Åpne eksperimentet som inneholder amplifikasjonsprogrammet og smeltekurveprogrammet. Klikk på Sample Editor i modullinjen , og velg deretter SCanning arbeidsflyt . Definer egenskapene til prøvene ( dvs. navn, ukjent eller negativ kontroll). Klikk Analyse i modullinjen . Velg Genskanning i listen Opprett ny Analyse . Klikk på Normalisering- fanen for å normalisere smeltekurver. Klikk på temperaturskiftfanen for å tilbakestille temperaturaksen (x-akse) til smeltekurver. MERK: Den nedre grafen viser smeltekurver som både er normalisert og temperaturforskjøvet. Klikk på Calculate- knappen for å analysere resultatene og avgjøre grupperingen. Klikk på fanen Difference plot i kartområdet for å vise Normaliserte og Shifted Smeltekurver og Normalisert og Temperaturforskyvet Difference Plot .

Representative Results

Figur 6 A viser fenotypingen av CR1-lengdepolymorfismen av WB. Figur 6 B og C viser kurvene som er oppnådd under HRM-PCR-analyse, som muliggjør bestemmelse av CR1-lengdepolymorfismen. Analyse av fusjonskurver ved bruk av programvaren etter høyoppløselig smelting av de PCR-avledede amplikonene fra det genomiske DNA hos personer med forskjellige CR1-isoformer, frembringer kurver som diskriminerer fag i henhold til deres allotypiske CR1-ekspressionsfenotyper. Figur 6 B viser en første presentasjonsmodus, kalt "Normaliserte og Shifted Smeltekurver", mens Figur 6 C viser en andre modus for presentasjon, kalt "Normalisert og Temp-Shifted Difference Plot." <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Kurvens profiler fordeles i henhold til gruppene som representerer fenotypene som vises i figur 6 A : (CR1 * 3, CR1 * 1); (CR1 * 1, CR1 * 2); CR1 * 1; CR1 * 2; Og (CR1 * 2, CR1 * 4). Dette muliggjør genotyping av CR1-lengdepolymorfismen ved hjelp av denne nye molekylærbiologi-metoden. Figur 1: Skjematisk fremstilling av strukturen og polymorfiene av komplement-reseptor 1-proteinet. Hver kort konsensusrepetisjon (SCR) eller komplementkontrollprotein (CCP) er representert ved en sirkel. SCRene er gruppert i en repeterende, høyere rekkefølge strukturer kalt LHRs. Fra det ekstracellulære domenet til cellemembranen er LHRene: LHR-A, -B, -C, -D og -S (tilleggs-eller ekstra LHR). I den vanligste CR1 isoformen(CR1 * 1), er C4b / decay-akselerasjonsaktivitets-DAA-bindingsstedet lokalisert ved LHR-A (SCRs 1-3, grønne sirkler), C3b / C4b / kofaktoraktivitets (CA) bindingsstedet er lokalisert i 3 N-terminale SCRs av LHR-B (SCR 8-10, røde sirkler) og LHR-C (SCRs 15-17, lilla sirkler) og bindingsstedet for C1q / MBL og ficolin finnes i LHR-D (SCRs 22-28, blå sirkler). De homologe strukturene er fargede identisk. CR1 * 2 (S) isoformen presenterer en ekstra LHR (LHR-S) og inneholder således et ytterligere C3b / C4b bindingssted. KDa, kilodalton. NRC, ikke-reduserte forhold. RC, reduserte forhold. TM, transmembrane domene. Denne figuren ble tilpasset fra Brouwers et al. 36 med tillatelse fra Nature Publishing Group. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src= "/files/ftp_upload/56012/56012fig2.jpg" /> Figur 2 : Skjematisk fremstilling av CR1-isoformstrukturen med sekvens amplikonposisjoner oppnådd ved HRM-PCR. Hver boks representerer en SCR. SCRene er gruppert i LHR: LHR-A, -B, -C og -D. De homologe strukturene er fargede identisk. CR1 * 2 og CR1 * 4 isoformene presenterer ekstra LHR (LHR-B) og inneholder således et ekstra amplikonområde (amplikon B, i rødt). CR1 * 3 mangler LHR-B og inneholder mindre amplikonområde (mangler amplikon B). Nukleotidforskjeller mellom amplikon B (196 bp) og invariant amplikon (197 bp) er avbildet i henholdsvis rød og blå. Forskjeller i forholdet: (amplikon B, i rød / invariant amplikon, i blått) mellom hver CR1 isoform bestemmes av HRM-PCR, som muliggjør genotyping. CN3- og CN3re-primersekvensene er understreket. TM, transmembrane domene. CYT, cytoplasmatisk hale.Pg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 3: Flowchart av protokollen for genotyping av CR1-lengdepolymorfismen fra humane blodprøver. Samle en human DNA-prøve. Ekstraher DNA til å oppnå en DNA blodprøve. Bestem DNA-konsentrasjonen og fortynn for å oppnå DNA-konsentrasjonen ved 10 ng / μl. Bruk HRM-PCR for å oppnå CR1-lengde polymorfisme genotypen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 4 : Skjermbilder av spektrofotometeret oss Ed for å bestemme DNA konsentrasjonen. Trykk 1 ( A ) for å velge DNA-modus på spektrofotometeret. Velg en 5 mm bane lengde ( B ) ved hjelp av venstre og høyre pilene ( C ). Velg enheten (μg / mL) ( D ) ved hjelp av venstre og høyre pilene ( C ). Velg fortynningsfaktor 1 ( E ) ved hjelp av venstre og høyre pilene ( C ). Velg en faktor på 50 ( F ) ved hjelp av venstre og høyre pil. Trykk på OK ( G ). Pipet 10 μl destillert vann inn i kuvetten. Sett kuvetten i spektrofotometeret ( H ). Trykk på OA / 100% T- knappen ( I ). Pipetter 10 μL DNA-prøve (1/4 fortynning i destillert vann) inn i kuvetten. Sett kuvetten i spektrofotometeret ( K ). Trykk på den grønne knappen (les / start) ( L ). Merk konsentrasjonen ( M ).Es / ftp_upload / 56012 / 56012fig4large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 5: Skjermbilder av det grafiske grensesnittet til programvaren som brukes i trinn 4 i protokollen. ( A ) Åpne genskanningsprogramvaren. ( B ) Forsterkningsprogram og smeltingskurveprogram. ( C ) Klikk på Sample Editor i modullinjen . ( D ) Velg skanning . ( E ) Definer egenskapene til prøvene. ( F ) Klikk på Analyse i modullinjen . ( G ) Klikk på Normalisering- fanen for å normalisere smeltekurver. ( H ) Klikk på Temperaturforskjell- fanen for å vise smeltekurver som begge erNormalisert og temperaturforskjøvet. ( I ) Klikk på Beregn- knappen for å analysere resultatene og avgjøre grupperingen. ( J ) Klikk på fanen Difference plot for å vise Normalisert og Shifted smeltekurver og Normalisert og Temperaturforskjell forskjell Plot . ( K ) Farget gruppering av prøvene i henhold til CR1-lengdegenotypene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 6: Fenotyping av CR1-lengdepolymorfiene observert i WB og deres tilhørende profilkurver oppnådd ved HRM-PCR. ( A ) Fenotyping av CR1-lengdepolymorfiene ved bruk av WB. ( B </stRong>) og ( C ) Genotyping av CR1-lengdepolymorfier ved hjelp av HRM-PCR-analyse. HRM-kurveanalyse av PCR-amplikoner oppnådd fra det genomiske DNA hos personer som viser forskjellige CR1-isoformer førte til identifisering av spesifikke kurveprofiler: (CR1 * 3, CR1 * 1) (lilla); (CR1 * 1, CR1 * 2) (blå); CR1 * 1 (grønn); CR1 * 2 (rød); Og (CR1 * 2, CR1 * 4) (grå). Disse korresponderer med CR1-lengdepolymorfisme alleler. Som vist ved de to presentasjonsmodusene – "Normaliserte og Shifted Smeltkurver" (B) og "Normalisert og Temp-Shifted Difference Plot" (C) -kurvprofilene fordeles i henhold til (CR1 * 3, CR1 * 1) ; (CR1 * 1, CR1 * 2); CR1 * 1; CR1 * 2; Og (CR1 * 2, CR1 * 4) grupper. Denne figuren ble tilpasset fra Mahmoudi et al. 38 med tillatelse fra Elsevier. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Her beskriver vi en allment tilgjengelig metode for å studere CR1-lengdepolymorfismer. Molekylbiologi teknikker for amplifikasjon eller segmental hybridisering har aldri vært i stand til å gi tilfredsstillende resultater som tillater bestemmelse av CR1 lengde polymorfismer i alle individer. Dette skyldes den gjentatte strukturen til CR1-genet ( dvs. de høyt repeterende SCRene til CR1). Molekylærbiologimetoden beskrevet her utnytter den kvantitative fordeling av LHR-B i CR1-molekylet. CR1-molekylet omfatter n LHR-B-domener, hvor n er et tall mellom 0 og 3, og bare ett LHR-C-domene, som beskrevet og illustrert i figur 2 . Kvantitativ domene B-deteksjon gjør det mulig å diskriminere perfekt ett ekstra eller manglende domene B.

Fra det ekstraherte genetiske materialet blir et første DNA-fragment fra LHR-B amplifisert ved PCR ved bruk av et enkelt par av bestemte primere, representereTing en karakteristisk variant av LHR-B kalt "variant amplikon B." Et andre DNA-fragment, kalt "invariant amplicon" og tilhører LHR-C, blir også forsterket. Dette andre DNA-fragmentet er et fragment av LHR-C, men et annet invariant fragment av LHR-A eller -D kan også brukes.

De to DNA-fragmentene, variant amplikon B og det invariante amplikon, amplifiseres av de samme primere og utviser fem forskjeller i nukleotidsekvenser. Denne karakteristikken gjør det mulig i det etterfølgende trinn å bestemme antall variant amplikon B og antall invariant amplikoner ved bruk av et kvantitativt molekylærbiologi verktøy, HRM, som var tilpasset for dette formål. Forholdet mellom antall amplikon B og invariant amplikon (forhold: amplikon B / invariant amplikon) varierer i henhold til lengden av CR1 molekylet. Faktisk viser CR1 * 4 3 amplikon B-enheter til 1 invariant amplikon, CR1 * 2 viser 2 amplikon B-enheter til 1 invariant amplikon, CR1 * 1 viser 1 amplikon B til 1 invariant amplikon, og CR1 * 3 viser 0 amplikon B-enheter til 1 invariant amplikon ( Figur 2 ). Denne HRM-PCR-metoden muliggjør således genotyping av CR1-lengdepolymorfismen.

Ikke desto mindre, i starten av studien, krever denne teknikken bruk av referansepersoner hvis CR1-fenotyper allerede er kjent ( dvs. tidligere etablert av WB) for å kunne etablere genotypingen av CR1 i henhold til referanseprofilen for kurver som er oppnådd Av HRM-PCR. To typer representasjon, nemlig "Normaliserte og Shifted Smeltekurver" og "Normalisert og Temp-Shifted Difference Plot," er tilgjengelige. De viser forskjellige grupper av kurveprofiler som er farget i henhold til CR1-lengdepolymorfismefenotyping oppnådd av WB ( figur 6 ). Fra trinnet "Normalisert og Shifted Smeltekurver" gjør vår metode det mulig å diskriminere thE forskjellige kurvkurver som svarer til isoformene til CR1, gruppert etter farge. Men "Normalisert og Temp Shifted Difference Plot", som tilsvarer en annen matematisk representasjon, muliggjør lettere visualisering av de forskjellige kurvgruppene. Selv om produsentens programvare var rutinemessig brukt i denne studien, kunne annen programvare (som uANALYSE) brukes som et datautvinningsprogram for kurveanalyse.

Hittil er WB-analyseteknikken den opprinnelige teknikken som muliggjør identifisering av de forskjellige CR1-lengdepolymorfiene på proteinnivået. Imidlertid har denne teknikken en rekke ulemper. Spesielt kan proteinanalyse av WB kun utføres etter ekstraksjon av cellemembraner. Som et resultat er det komplisert og svært tidkrevende. Videre krever denne teknikken å oppnå en fersk blodprøve under passende betingelser ved begynnelsen av prosedyren for å oppnå nyttig results. Tvert imot gjør HRM-PCR utført på DNA det mulig å bruke til og med tørre blodpunkter eller prøver etter langvarig lagring. HMR-PCR krever et spesialisert DNA smelteinstrument, enten et dedikert instrument eller en HMR-kapasitets termocykler med HRM-programvare. SNP-deteksjon er avhengig av flere faktorer: i) SNPs inkludert i store PCR-fragmenter er vanskeligere å oppdage enn de samme SNPene i små PCR-fragmenter; Ii) SNP som tilhører klasse III og IV er vanskeligere å oppdage enn i klasse I og II 34 ; Og iii) SNPs som er flankert av nærmeste nabosokksymmetri ( f.eks. 5'-G (G / C) C-3 ') kan ikke sorteres ved smelting, uavhengig av oppløsningsstyrken til HMR-plattformen. Det kan være nyttig å teste de forutsagte PCR-fragmentene som inneholder SNP av interesse med uMELT-programvaren 35 for å vurdere validiteten av analysen. Endelig er HMR-PCR en analog metode, noe som betyr at likningen av smeltekurver satserVei en referanse og en mal betyr ikke nødvendigvis at malingssekvensen er identisk med referansen, da mal-sekvensen kan være forskjellig fra referansen, men termodynamisk ekvivalent. Disse begrensningene gjelder imidlertid ikke for fremgangsmåten beskrevet her, som er basert på smeltingen av en blanding av amplikoner som varierer i form av 5 nukleotidsekvenser.

I tillegg har teknikken beskrevet her, basert på analysen av HRM, mange fordeler. For det første bestemmes CR1-lengdepolymorfismene raskere, siden resultatene oppnås i ca. 2 timer når utvinningen av det genetiske materialet er utført. Omvendt krever tradisjonelle biokjemiske teknikker basert på WB-proteinanalyse trinn som er relativt lange: elektroforese av cellemembranekstrakter gjennom en akrylamidgel, et trinn for å overføre proteiner til en nitrocellulose- eller polyvinylidenfluorid-membran (PVDF) og et trinn for å identifisere Isoformer avCR1-molekyl ved immunokemiluminescens. For det andre har HRM-PCR-teknikken også fordelen av å ikke være for dyrt, noe som er spesielt viktig for en metode som sannsynligvis vil bli brukt på mange individer ( dvs. i stor grad) for å bestemme deres følsomhet for utvikling av patologier som Alzheimers sykdom, Lupus eller malaria.

Nylig har vi og andre vist at CR1 * 2 isoformen, som inneholder ett ekstra C3b / C4b bindingssted, var assosiert med AD 36 , 37 , 38 . I vår tidligere publiserte studie var CR1-lengdepolymorfiene på nivået av genet og proteinet konsistente hos 98,9% av individene 38 . De uoverensstemmende resultatene som ble oppnådd ved sammenligning av lengdepolymorfier oppnådd ved HRM-PCR med de som ble oppnådd ved WB, korresponderte med personer med en (CR1 * 1, CR1 * 2) genotypeprofil bestemt av HRM (gen), men exPresser bare CR1 * 1 isoformen på overflaten av erytrocyten i henhold til WB (protein). I studien var mangelen på CR1 * 2-isoformuttrykk (enkeltpersoner som bærer en stille allel) reproduserbare når WB ble utført med en lengre eksponeringstid og kunne forklares ved eksistensen av et stille CR1-allel (CR1 * 2), beskrevet I litteraturen av Helgeson 39 . Likevel er det behov for ytterligere studier på større populasjoner for å støtte denne hypotesen.

Det skal bemerkes at private SNPer (SNPs som bare forekommer i en liten familiegruppe eller til og med i et enkelt individ) førte til forskjellige kurveprofiler som skal dechifreres ved hjelp av referansefotypebestemmelse (WB), men som ikke kan forveksles med den kanoniske profilen for å unngå Enhver feilfortolkning av CR1-lengdepolymorfisgenotypen.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker alle medlemmer av Plateforme Régionale de Biologie Innovante, ansatte ved Institutt for immunologi, og medarbeiderne ved Institutt for internmedisin og geriatri, som bidro til å optimalisere og validere protokollen. Dette arbeidet ble finansiert av Reims Universitetssykehus (bevilgningsnummer AOL11UF9156). Vi takker også Fiona Ecarnot (EA3920, Universitetssykehus Besancon, Frankrike) for redaksjonell assistanse.

Materials

Lab coat protection
SensiCareIce powder-free Nitrile Exam gloves Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA 486802 sample protection
Eppendorf Reference 2 pipette, 0,5-10µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000024 sample pipetting
Eppendorf Reference 2 pipette, 20-100µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000059 sample pipetting
Eppendorf Reference 2 pipette, 100-1000µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000083 sample pipetting
TipOne 10µL Graduated, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1121-3810 sample pipetting
TipOne 1-100µL bevelled, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1120-1840 sample pipetting
ART 1000E Barrier Tip Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 2079E sample pipetting
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 0030120086 mix
Vortex-Genie 2 Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA SI-0236 mix
QIAamp DNA Mini Kit (250) Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France 51306 DNA Extraction
Buffer AL Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France 19075 Lysis buffer
QIAamp Mini Spin Column Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France 1011706 DNA binding
Buffer AW1 Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France 19081 Wash buffer
Buffer AW2 Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France 19072 Wash buffer
Biowave DNA spectrophotometer Biochrom Ltd, Cambridge CB4 OFJ, England 80-3004-70 DNA concentration 
Mikro 200 centrifuge Hettich Zentrifugen, D-78532, Germany 0002020-02-00 centrifugation
Eppendorf Combitips advanced, 1.0 mL, Eppendorf Biopur Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 0030089642 distribution
Multipette E3 Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4987000010 distribution
Light Cycler 480 multiwell plate 96, white Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany 04729692001 reaction place
Light Cycler 480 sealing foil Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany 04429757001 coverage
Heraeus Megafuge 11R centrifuge Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 75004412 centrifugation
LightCycler 480 Instrument II, 96-well Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany 05015278001 high resolution melting polymerase chain reaction
LightCycler 480 High Resolution Melting Master Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany 04909631001 reaction reagents
light cycler 480 SW 1.5.1 software Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany software used for HRM PCR CR1 polymorphism data analysis
CN3 primer: 5'ggccttagacttctcctgc 3' Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgium reaction reagent
CN3re primer: 5'gttgacaaattggcggcttcg 3' Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgium reaction reagent
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Prince, M., et al. World Alzheimer Report 2015, The Global Impact of Dementia: An analysis of prevalence, incidence, cost and trends. Alzheimer’s Disease International. , (2015).
  2. McKhann, G. M., et al. The diagnosis of dementia due to Alzheimer’s disease: recommendations from the National Institute on Aging-Alzheimer’s Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer’s disease. Alzheimers Dement. 7 (3), 263-269 (2011).
  3. Serrano-Pozo, A., Frosch, M. P., Masliah, E., Hyman, B. T. Neuropathological alterations in Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), 006189 (2011).
  4. Goate, A., et al. Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer’s disease. Nature. 349 (6311), 704-706 (1991).
  5. Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer’s disease. Nature. 375 (6534), 754-760 (1995).
  6. Levy-Lahad, E., et al. A familial Alzheimer’s disease locus on chromosome 1. Science. 269 (5226), 970-973 (1995).
  7. Mayeux, R., Stern, Y. Epidemiology of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (8), (2012).
  8. Corder, E. H., et al. Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer’s disease in late onset families. Science. 261 (5123), 921-923 (1993).
  9. Yu, J. T., Tan, L., Hardy, J. Apolipoprotein E in Alzheimer’s disease: an update. Annu Rev Neurosci. 37, 79-100 (2014).
  10. Lambert, J. C., et al. Genome-wide association study identifies variants at CLU and CR1 associated with Alzheimer’s disease. Nat Genet. 41 (10), 1094-1099 (2009).
  11. Liu, D., Niu, Z. X. The structure, genetic polymorphisms, expression and biological functions of complement receptor type 1 (CR1/CD35). Immunopharmacol Immunotoxicol. 31 (4), 524-535 (2009).
  12. Jacquet, M., et al. Deciphering complement receptor type 1 interactions with recognition proteins of the lectin complement pathway. J Immunol. 190 (7), 3721-3731 (2013).
  13. Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
  14. Cosio, F. G., Shen, X. P., Birmingham, D. J., Van Aman, M., Hebert, L. A. Evaluation of the mechanisms responsible for the reduction in erythrocyte complement receptors when immune complexes form in vivo in primates. J Immunol. 145 (12), 4198-4206 (1990).
  15. Krych-Goldberg, M., Moulds, J. M., Atkinson, J. P. Human complement receptor type 1 (CR1) binds to a major malarial adhesin. Trends Mol Med. 8 (11), 531-537 (2002).
  16. Cohen, J. H., Geffriaud, C., Caudwell, V., Kazatchkine, M. D. Genetic analysis of CR1 (the C3b complement receptor, CD35) expression on erythrocytes of HIV-infected individuals. Aids. 3 (6), 397-399 (1989).
  17. Rogers, J., et al. Complement activation by beta-amyloid in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (21), 10016-10020 (1992).
  18. Rogers, J., et al. Peripheral clearance of amyloid beta peptide by complement C3-dependent adherence to erythrocytes. Neurobiol Aging. 27 (12), 1733-1739 (2006).
  19. Krych-Goldberg, M., Atkinson, J. P. Structure-function relationships of complement receptor type 1. Immunol Rev. 180, 112-122 (2001).
  20. Klickstein, L. B., et al. Human C3b/C4b receptor (CR1). Demonstration of long homologous repeating domains that are composed of the short consensus repeats characteristics of C3/C4 binding proteins. J Exp Med. 165 (4), 1095-1112 (1987).
  21. Hourcade, D., Miesner, D. R., Atkinson, J. P., Holers, V. M. Identification of an alternative polyadenylation site in the human C3b/C4b receptor (complement receptor type 1) transcriptional unit and prediction of a secreted form of complement receptor type 1. J Exp Med. 168 (4), 1255-1270 (1988).
  22. Krych, M., Hourcade, D., Atkinson, J. P. Sites within the complement C3b/C4b receptor important for the specificity of ligand binding. Proc Natl Acad Sci USA. 88 (10), 4353-4357 (1991).
  23. Krych-Goldberg, M., et al. Decay accelerating activity of complement receptor type 1 (CD35). Two active sites are required for dissociating C5 convertases. J Biol Chem. 274 (44), 31160-31168 (1999).
  24. Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
  25. Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. J Exp Med. 192 (12), 1797-1808 (2000).
  26. Cornillet, P., Philbert, F., Kazatchkine, M. D., Cohen, J. H. Genomic determination of the CR1 (CD35) density polymorphism on erythrocytes using polymerase chain reaction amplification and HindIII restriction enzyme digestion. J Immunol Methods. 136 (2), 193-197 (1991).
  27. Moulds, J. M., Nickells, M. W., Moulds, J. J., Brown, M. C., Atkinson, J. P. The C3b/C4b receptor is recognized by the Knops, McCoy, Swain-langley, and York blood group antisera. J Exp Med. 173 (5), 1159-1163 (1991).
  28. Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sang. 62 (4), 230-235 (1992).
  29. Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. J Exp Med. 164 (1), 50-59 (1986).
  30. Wong, W. W., et al. Structure of the human CR1 gene. Molecular basis of the structural and quantitative polymorphisms and identification of a new CR1-like allele. J Exp Med. 169 (3), 847-863 (1989).
  31. Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in Caucasian and African American populations. Clin Immunol Immunopathol. 87 (2), 176-183 (1998).
  32. Rowe, J. A., et al. Erythrocyte CR1 expression level does not correlate with a HindIII restriction fragment length polymorphism in Africans; implications for studies on malaria susceptibility. Genes Immun. 3 (8), 497-500 (2002).
  33. Birmingham, D. J., et al. A polymorphism in the type one complement receptor (CR1) involves an additional cysteine within the C3b/C4b binding domain that inhibits ligand binding. Mol Immunol. 44 (14), 3510-3516 (2007).
  34. Venter, J. C., et al. The sequence of the human genome. Science. 291 (5507), 1304-1351 (2001).
  35. Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
  36. Brouwers, N., et al. Alzheimer risk associated with a copy number variation in the complement receptor 1 increasing C3b/C4b binding sites. Mol Psychiatry. 17 (2), 223-233 (2012).
  37. Hazrati, L. N., et al. Genetic association of CR1 with Alzheimer’s disease: a tentative disease mechanism. Neurobiol Aging. 33 (12), 2945-2949 (2012).
  38. Mahmoudi, R., et al. Alzheimer’s disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiol. Aging. 36, 1712-1765 (2015).
  39. Helgeson, M., Swanson, J., Polesky, H. F. Knops-Helgeson (Kna), a high-frequency erythrocyte antigen. Transfusion. 10 (3), 137-138 (1970).

Tags

Complement Receptor 1 Length PolymorphismHigh-resolution Melting PCRAlzheimer’s DiseaseGenotypingNeuroscienzeDNA ExtractionProteinase KLysis BufferEthanolMembrane Column
check_url/it/56012?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Kisserli, A., Tabary, T., Cohen, J. H. M., Duret, V., Mahmoudi, R. High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer’s Disease Gene Susceptibility Assessment. J. Vis. Exp. (125), e56012, doi:10.3791/56012 (2017).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image