En filtreringsbaseret metode til fremstilling af højkvalitetsnuclei fra tværbundet skeletsmuskel til chromatinimmunpræcipitation
Summary
Vi præsenterer en filtreringsbaseret protokol til isolering af kerne af høj kvalitet fra tværbundet museskeletmuskulatur, hvor vi fjernede behovet for ultracentrifugering, hvilket gør det let anvendeligt. Vi viser, at kromatin fremstillet ud fra kernerne er egnet til chromatinimmunpræcipitation og sandsynligvis chromatinimmunpræcipitationssekventeringsundersøgelser.
Abstract
Kromatinimmunudfældning (ChIP) er en kraftfuld metode til bestemmelse af proteinbinding til chromatin-DNA. Fiber-rige skeletmuskler har imidlertid været en udfordring for ChIP på grund af tekniske vanskeligheder i isolation af højkvalitetskerner med minimal forurening af myofibriller. Tidligere protokoller har forsøgt at rense kerner inden krydsbinding, hvilket medfører risikoen for ændret DNA-proteininteraktion under den forlængede kerneforberedelsesproces. I den nuværende protokol tværbindede vi først skeletmuskelvævet opsamlet fra mus, og vævene blev hakket og sonikeret. Da vi fandt ud af, at ultracentrifugering ikke var i stand til at adskille kerner fra myofibriller ved anvendelse af tværbundet muskelvæv, udtænkte vi en sekventiel filtreringsprocedure for at opnå højkvalitets kerner uden væsentlig myofibrilforurening. Vi fremstillede efterfølgende chromatin ved anvendelse af en ultralydator, og ChIP-assays med anti-BMAL1-antistof afslørede robust cirkadisk bindingMønster af BMAL1 for at målrette genpromotorer. Denne filtreringsprotokol udgør en let anvendelig metode til isolering af kerne af høj kvalitet fra tværbundet skeletmuskulaturvæv, hvilket muliggør konsekvent prøvebehandling til cirkadian og andre tidsfølsomme undersøgelser. I kombination med næste generations sekventering (NGS) kan vores metode implementeres til forskellige mekaniske og genomiske undersøgelser med fokus på skeletmuskelfunktion.
Introduction
Skeletmuskel spiller vigtige roller i fysiologi og adfærd. Den multikernerede muskelfiber består af myofibriller, hvor actin og myosin danner funktionelle enheder kaldet sarcomerer for at danne kontraktilkraft. Skeletmuskler er også det største stofskifteorgan i kroppen, der tegner sig for> 80% postprandial glukoseindtagelse og regulerer insulinrespons og metabolisk homeostase 1 , 2 . Muskelfysiologi og stofskifte er tæt reguleret af det cirkadiske ur, en iboende biologisk timer 3 , 4 , 5 , 6 . For eksempel resulterede den skeletmuskelspecifikke deletion af Bmal1 , en af de kernekredittiske urkomponenter , insulinresistens og nedsat glukoseoptagelse i skeletmuskel, og dyrene viste sig at udvikle type 2-diabetes 7 . jegN-tillæg bliver skeletmuskel også i stigende grad værdsat som et hormon 8 , der udskiller myokiner for at regulere systemisk metabolisme og fysiologi. Mekanistiske undersøgelser er nødvendige for fuldt ud at forstå disse regulatoriske funktioner i skeletmuskel.
ChIP er en kraftfuld tilgang til afgrænsning af promotor rekruttering af DNA-bindende proteiner. ChIP blev oprindeligt udviklet til at identificere nukleosomorganisering på chromatin DNA 9 , 10 . En række fremgangsmåder er siden blevet rapporteret til tværbindingsproteiner og chromatin-DNA ved anvendelse af formaldehyd, dimethylsulfat eller ultraviolet bestråling (UV) 11 , 12 . Formaldehyd-tværbinding er den mest almindeligt anvendte, konserverende kromatinstruktur og DNA-proteininteraktioner 9 , 13 , 14 . Tværbundet kromatografiIn er shredded ved sonication og immunpræcipiteret med antistof mod det specifikke DNA-bindende protein af interesse 15 , 16 . I de senere år er ChIP-sekventering (ChIP-seq), en metode, der kombinerer ChIP med NGS, udviklet for at forhøre genomfattende transkriptionsfaktorbinding 17 og i nogle tilfælde at overvåge dynamiske ændringer over et tidsforløb 18 , 19 , 20 . For eksempel har circadian-ChIP-seq-studier afsløret en stærkt orkestreret sekvens af genomisk binding af kredsløbskomponenter og histonmarkører, som dirigerer temporært præcis genekspression gennem hele den 24-timers cirkadiske cyklus 18 .
De fleste tilgængelige ChIP-protokoller er designet til blødt væv ( fx lever, hjerne osv. ), Og meget få er blevet offentliggjort til hårdt væv inklusive skeleTal muskler. Det er teknisk udfordrende at homogenisere fiberrig skeletmuskel og isolere højkvalitets kerne 21 , især til ChIP-eksperimenter, som kræver tværbinding. I en nylig muskel-ChIP-undersøgelse 22 blev satellitceller adskilt fra myofibere, og kerner blev fremstillet ud fra begge celletyper gennem en forlænget procedure, der involverer vævsfordøjelse. Hele processen tog cirka tre timer at afslutte før formaldehyd-tværbinding blev udført på isolerede kerner. Selvom denne procedure undgik krydsbinding af muskelfibre, hvilket gør muskelvæv endnu mere ildfast til effektiv homogenisering og var i stand til at producere kerne af høj kvalitet, medfører den betydelige tidsforsinkelse fra vævsopsamling til kerneforbindelser risikoen for ændret DNA -proteininteraktion. I modsætning hertil udførte de fleste undersøgelser tværbinding umiddelbart efter forsøgsbehandling eller vævsopsamling for at bevare real-time DNA-proteiN bindende 12 . En anden ulempe ved kerneisolation før tværbinding er, at den udelukker tidsfølsomme anvendelser såsom cirkadisk prøveopsamling, som typisk forekommer med intervaller på 3 – 4 timer. Uden krydsbinding af kernerne skal isolationen fortsætte umiddelbart efter dissektion, mens tværbundne prøver kan behandles sammen, efter at hele tidskursus er afsluttet, hvilket sikrer større eksperimentel konsistens.
Andre protokoller for kerneisolation fra ikke-tværbundet skeletmuskel er også blevet rapporteret. To undersøgelser beskrev brugen af gradient ultracentrifugering til adskillelse af kerner fra resterende myofibriller og celleaffald 23 , 24 . Selvom sukrose eller kolloidal gradient ultracentrifugering er effektiv med ikke-tværbundne muskelvæv, viste vores eksperimenter, at efter krydsbinding mislykkedes gradient-ultracentrifugering til at adskille kerner fra celle dEbris på graden.
Vi udviklede derfor en procedure til isolering af kerne af høj kvalitet ved anvendelse af tværbundne muskelvæv i muskelskelet. I stedet for gradient ultracentrifugering udtænkte vi en seriefiltreringsmetode til effektivt at adskille kerner fra affald. Efter ultralydning blev chromatinprøverne succesfuldt anvendt til ChIP-undersøgelser, der viste et cirkadisk mønster af BMAL1-proteinbinding til målpromotorer. Vores metode kan bredt anvendes til forskellige mekaniske studier af muskelvæv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en robust metode, hvor tværbundet skeletmuskelvæv blev brugt til at isolere kerne af høj kvalitet. Sekventiel filtrering blev udført for effektivt at adskille kerner fra affald, og ultralydsakustisk energi fra skålformet transducer skåret kromatinet til ChIP-analyse. Resultaterne viste cirkadisk tidsspecifik binding af BMAL1 til målpromotorer.
ChIP kan anvendes til at indfange realtidsproteinbelægning på genomisk DNA, når tværbindingen finder sted. For at udnytte …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Karyn Esser, Nobuya Koike og Noheon Park for nyttige råd. Dette arbejde blev delvist støttet af NIH / NIGMS (R01GM114424) til S.-HY, og Robert A. Welch Foundation (AU-1731) og NIH / NIA (R01AG045828) til ZC
Materials
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318-579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
Riferimenti
- Bouzakri, K., et al. siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle. Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. The meter of metabolism. Cell. 134 (5), 728-742 (2008).
- Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat Chem Biol. 3 (10), 630-639 (2007).
- Harfmann, B. D., Schroder, E. A., Esser, K. A. Circadian rhythms, the molecular clock, and skeletal muscle. J Biol Rhythms. 30 (2), 84-94 (2015).
- Nohara, K., Yoo, S. H., Chen, Z. J. Manipulating the circadian and sleep cycles to protect against metabolic disease. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 35 (2015).
- Harfmann, B. D., et al. Muscle-specific loss of Bmal1 leads to disrupted tissue glucose metabolism and systemic glucose homeostasis. Skelet Muscle. 6, 12 (2016).
- Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Jackson, V. Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent. Cell. 15 (3), 945-954 (1978).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Takahashi, J. S., et al. ChIP-seq and RNA-seq methods to study circadian control of transcription in mammals. Methods Enzymol. 551, 285-321 (2015).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Chen, Z., Manley, J. L. Core promoter elements and TAFs contribute to the diversity of transcriptional activation in vertebrates. Mol Cell Biol. 23 (20), 7350-7362 (2003).
- Menet, J. S., Abruzzi, K. C., Desrochers, J., Rodriguez, J., Rosbash, M. Dynamic PER repression mechanisms in the Drosophila circadian clock: from on-DNA to off-DNA. Genes Dev. 24 (4), 358-367 (2010).
- Miki, T., Matsumoto, T., Zhao, Z., Lee, C. C. p53 regulates Period2 expression and the circadian clock. Nat Commun. 4, 2444 (2013).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Koike, N., et al. Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals. Science. 338 (6105), 349-354 (2012).
- Zhou, J., Yu, W., Hardin, P. E. ChIPping away at the Drosophila clock. Methods Enzymol. 551, 323-347 (2015).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. , (2016).
- Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. Isolation of skeletal muscle nuclei. J Cell Biol. 27 (2), 365-377 (1965).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Isolation of nuclei from skeletal muscle satellite cells and myofibers for use in chromatin immunoprecipitation assays. Methods Mol Biol. 798, 517-530 (2012).
- Wilkie, G. S., Schirmer, E. C. Purification of nuclei and preparation of nuclear envelopes from skeletal muscle. Methods Mol Biol. 463, 23-41 (2008).
- Hahn, C. G., Covault, J. Isolation of transcriptionally active nuclei from striated muscle using Percoll density gradients. Anal Biochem. 190 (2), 193-197 (1990).
- Jeong, K., et al. Dual attenuation of proteasomal and autophagic BMAL1 degradation in Clock Delta19/+ mice contributes to improved glucose homeostasis. Scientific reports. 5, 12801 (2015).
- Nohara, K., et al. Ammonia-lowering activities and carbamoyl phosphate synthetase 1 (Cps1) induction mechanism of a natural flavonoid. Nutrition & metabolism. 12, 23 (2015).
- Zhang, L., Rubins, N. E., Ahima, R. S., Greenbaum, L. E., Kaestner, K. H. Foxa2 integrates the transcriptional response of the hepatocyte to fasting. Cell Metab. 2 (2), 141-148 (2005).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
- Kondratov, R. V., et al. BMAL1-dependent circadian oscillation of nuclear CLOCK: posttranslational events induced by dimerization of transcriptional activators of the mammalian clock system. Genes Dev. 17 (15), 1921-1932 (2003).
- Ripperger, J. A., Schibler, U. Rhythmic CLOCK-BMAL1 binding to multiple E-box motifs drives circadian Dbp transcription and chromatin transitions. Nat Genet. 38 (3), 369-374 (2006).
- Laplante, M., et al. DEPTOR cell-autonomously promotes adipogenesis, and its expression is associated with obesity. Cell Metab. 16 (2), 202-212 (2012).
- Blechman, J., Amir-Zilberstein, L., Gutnick, A., Ben-Dor, S., Levkowitz, G. The metabolic regulator PGC-1alpha directly controls the expression of the hypothalamic neuropeptide oxytocin. J Neurosci. 31 (42), 14835-14840 (2011).
