Une méthode à base de filtration pour la préparation de noyaux de haute qualité à partir d'un muscle squelettique réticulé pour l'immunoprécipitation de la chromatine
Summary
Nous présentons un protocole basé sur la filtration pour isoler des noyaux de haute qualité à partir du muscle squelettique de souris réticulé dans lequel nous avons supprimé le besoin d'ultracentrifugation, ce qui le rend facilement applicable. Nous montrons que la chromatine préparée à partir des noyaux est appropriée pour l'immunoprécipitation de la chromatine et les études probables de séquençage de l'immunoprécipitation de la chromatine.
Abstract
L'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une méthode puissante pour déterminer la liaison des protéines à l'ADN de la chromatine. Le muscle squelettique riche en fibres a toutefois été un défi pour le ChIP en raison de difficultés techniques en isolement de noyaux de haute qualité avec une contamination minimale des myofibrilles. Les protocoles antérieurs ont tenté de purifier les noyaux avant la réticulation, ce qui entraîne une altération de l'interaction ADN-protéine pendant le processus de préparation des noyaux prolongés. Dans le protocole actuel, nous avons d'abord réticulé le tissu musculaire squelettique recueilli chez la souris et les tissus ont été hachés et sonicés. Comme nous avons constaté que l'ultracentrifugation n'était pas capable de séparer les noyaux des myofibrilles à l'aide d'un tissu musculaire réticulé, nous avons mis au point une procédure de filtration séquentielle pour obtenir des noyaux de haute qualité dépourvus de contamination significative par myofibrilles. Nous avons ensuite préparé la chromatine en utilisant un ultrasons, et les tests de ChIP avec anticorps anti-BMAL1 ont révélé une liaison circadienne robusteModèle de BMAL1 pour cibler les promoteurs de gènes. Ce protocole de filtration constitue une méthode facilement applicable pour isoler des noyaux de haute qualité à partir d'un tissu musculaire squelettique réticulé, ce qui permet un traitement cohérent des échantillons pour les études circadiennes et autres études sensibles au temps. En combinaison avec le séquençage de la prochaine génération (NGS), notre méthode peut être déployée pour diverses études mécaniques et génomiques axées sur la fonction du muscle squelettique.
Introduction
Le muscle squelettique joue un rôle important dans la physiologie et le comportement. La fibre musculaire multi-nucléée se compose de myofibrilles où l'actine et la myosine forment des unités fonctionnelles appelées sarcomères pour générer une force contractile. Le muscle squelettique est également le plus grand organe métabolique du corps, ce qui représente> 80% d'apport de glucose postprandial et de régulation de la réponse à l'insuline et de l'homéostasie métabolique 1 , 2 . La physiologie musculaire et le métabolisme sont étroitement réglementés par l'horloge circadienne, une minuterie biologique intrinsèque 3 , 4 , 5 , 6 . Par exemple, la suppression spécifique du muscle squelettique de Bmal1 , l'un des composants de l'horloge circadienne centrale, a entraîné une résistance à l'insuline et une diminution de l'absorption du glucose dans le muscle squelettique, et on a constaté que les animaux développaient un diabète de type 2 7 . jeEn outre, le muscle squelettique est de plus en plus apprécié en tant qu'organe endocrinien 8 , sécrétant les myokines pour réguler le métabolisme systémique et la physiologie. Des études mécanistiques sont nécessaires pour bien comprendre ces fonctions réglementaires dans le muscle squelettique.
ChIP est une approche puissante pour délimiter le recrutement par le promoteur de protéines de liaison à l'ADN. ChIP a d'abord été développé pour identifier l'organisation des nucléosomes sur l'ADN de la chromatine 9 , 10 . Depuis, on a signalé que diverses méthodes ont réticulé les protéines et l'ADN de la chromatine en utilisant du formaldéhyde, du sulfate de diméthyle ou de l'irradiation ultraviolette (UV) 11 , 12 . La réticulation du formaldehyde est la structure la plus utilisée, la structure de la chromatine et les interactions ADN-protéine 9 , 13 , 14 . Chromatographie réticuléeIn est déchiqueté par sonication et immunoprécipité avec un anticorps contre la protéine de liaison d'ADN spécifique 15 , 16 . Au cours des dernières années, le séquençage par ChIP (ChIP-seq), une méthode combinant ChIP avec NGS, a été développé pour interroger le facteur de transcription du génome à l'échelle du 17 et, dans certains cas, pour surveiller les changements dynamiques au cours d'un cours 18 , 19 , 20 . Par exemple, les études circadiennes ChIP-seq ont révélé une séquence hautement orchestrée de liaison génomique des composants de l'horloge circadienne et des marqueurs d'histones, ce qui entraîne une expression du gène temporellement précise tout au long du cycle circadien de 24 heures 18 .
La plupart des protocoles ChIP disponibles sont conçus pour les tissus mous ( par exemple, le foie, le cerveau, etc. ) et très peu ont été publiés pour les tissus durs, y compris le squeletteMuscle. Il est techniquement difficile d'homogénéiser le muscle squelettique riche en fibres et d'isoler les noyaux de haute qualité 21 , en particulier pour les expériences ChIP qui nécessitent une réticulation. Dans une récente étude sur le muscle ChIP 22 , les cellules satellites ont été séparées des myofibres et des noyaux ont été préparés à partir des deux types de cellules par une procédure prolongée impliquant une digestion des tissus. L'ensemble du processus a duré environ trois heures avant de procéder à la réticulation du formaldéhyde sur des noyaux isolés. Bien que cette procédure ait évité de reticuler la fibre musculaire, ce qui rend le tissu musculaire encore plus réfractaire à une homogénéisation efficace et a pu produire des noyaux de haute qualité, le retard important de la collecte des tissus à la réticulation des noyaux entraîne le risque d'ADN altéré -interaction des protéines. En revanche, la plupart des études ont réalisé une réticulation immédiatement après un traitement expérimental ou une collecte de tissu afin de préserver l'ADN-protéi en temps réelN liaison 12 . Un deuxième inconvénient de l'isolement des noyaux avant la réticulation est qu'il empêche les applications sensibles au temps telles que la collecte d'échantillon circadien qui se produit habituellement à des intervalles de 3 à 4 h. Sans reticuler les noyaux, l'isolement doit se dérouler immédiatement après la dissection, alors que les échantillons réticulés peuvent être traités ensemble après la fin du cours, ce qui garantit une plus grande cohérence expérimentale.
D'autres protocoles pour l'isolement des noyaux à partir de muscle squelettique non réticulé ont également été rapportés. Deux études ont décrit l'utilisation de l'ultracentrifugation en gradient pour séparer les noyaux des myofibrilles restantes et des débris cellulaires 23 , 24 . Alors que le sucrose ou l'ultracentrifugation en gradient colloïdal est efficace avec les tissus musculaires non réticulés, nos expériences ont révélé qu'après la réticulation, l'ultracentrifugation en gradient n'a pas réussi à séparer les noyaux de la cellule dEbris sur le dégradé.
Nous avons donc développé une procédure pour isoler des noyaux de haute qualité en utilisant des tissus de muscle squelettique de souris réticulés. Plutôt que de l'ultracentrifugation en gradient, nous avons conçu une méthode de filtration en série pour séparer efficacement les noyaux des débris. À la suite de l'échographie, les échantillons de chromatine ont été appliqués avec succès pour des études de ChIP qui ont montré un schéma circadien de liaison de la protéine BMAL1 aux promoteurs cibles. Notre méthode peut être largement applicable à diverses études mécanistes des tissus musculaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici une méthode robuste où les tissus de muscles squelettiques réticulés ont été utilisés pour isoler des noyaux de haute qualité. La filtration séquentielle a été effectuée pour séparer efficacement les noyaux des débris et l'énergie acoustique ultrasonore du transducteur en forme de plat a percé la chromatine pour l'analyse de ChIP. Les résultats ont montré une liaison circadienne spécifique au temps de BMAL1 aux promoteurs cibles.
ChIP peut être…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Karyn Esser, Nobuya Koike et Noheon Park pour des conseils utiles. Ce travail a été partiellement soutenu par NIH / NIGMS (R01GM114424) à S.-HY, et la Fondation Robert A. Welch (AU-1731) et NIH / NIA (R01AG045828) à ZC
Materials
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318-579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
Riferimenti
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