Eine Filtrations-basierte Methode zur Herstellung von hochwertigen Nuklei aus vernetzten Skelettmuskeln für Chromatin-Immunpräzipitation
Summary
Wir präsentieren ein Filtrations-basiertes Protokoll, um qualitativ hochwertige Kerne aus vernetzten Mäuseskelettmuskeln zu isolieren, wobei wir die Notwendigkeit einer Ultrazentrifugation entfernt haben, wodurch es leicht anwendbar ist. Wir zeigen, dass das aus den Kernen hergestellte Chromatin für die Chromatin-Immunpräzipitation und wahrscheinlich Chromatin-Immunpräzipitations-Sequenzierungsstudien geeignet ist.
Abstract
Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist eine leistungsfähige Methode zur Bestimmung der Proteinbindung an Chromatin-DNA. Faserreicher Skelettmuskel war jedoch eine Herausforderung für ChIP aufgrund technischer Schwierigkeiten bei der Isolierung von hochwertigen Kernen mit minimaler Kontamination von Myofibrillen. Bisherige Protokolle haben versucht, Kerne vor der Vernetzung zu reinigen, was das Risiko einer veränderten DNA-Protein-Wechselwirkung während des verlängerten Keimpräparationsverfahrens verursacht. In dem aktuellen Protokoll haben wir zuerst das Skelettmuskelgewebe, das von Mäusen gesammelt wurde, vernetzt und die Gewebe wurden gehackt und beschallt. Da wir festgestellt haben, dass die Ultrazentrifugation nicht in der Lage war, Kerne von Myofibrillen unter Verwendung von vernetzten Muskelgeweben zu trennen, entwickelten wir ein sequentielles Filtrationsverfahren, um qualitativ hochwertige Kerne ohne signifikante Myofibrillenverunreinigung zu erhalten. Anschließend wurden Chromatin unter Verwendung eines Ultraschallgerätes hergestellt und ChIP-Assays mit anti-BMAL1-Antikörper zeigten eine robuste zirkadiane BindungMuster von BMAL1 zu Zielgen-Promotoren. Dieses Filtrationsprotokoll stellt eine leicht anwendbare Methode dar, um qualitativ hochwertige Kerne aus vernetzten Skelettmuskelgeweben zu isolieren, was eine konsistente Probenverarbeitung für zirkadiane und andere zeitempfindliche Studien ermöglicht. In Kombination mit der Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) kann unsere Methode für verschiedene mechanistische und genomische Studien eingesetzt werden, die sich auf die Skelettmuskelfunktion konzentrieren.
Introduction
Skelettmuskel spielt eine wichtige Rolle in Physiologie und Verhalten. Die mehrkernige Muskelfaser besteht aus Myofibrillen, in denen Aktin und Myosin funktionale Einheiten bilden, die Sarkomere genannt werden, um kontraktile Kraft zu erzeugen. Skelettmuskel ist auch das größte Stoffwechselorgan im Körper, das für> 80% postprandiale Glukoseaufnahme und regulierende Insulinreaktion und metabolische Homöostase 1 , 2 verantwortlich ist . Die Muskelphysiologie und der Stoffwechsel werden durch die zirkadiane Uhr, einen intrinsischen biologischen Timer 3 , 4 , 5 , 6, genau reguliert. Zum Beispiel führte die Skelettmuskelspezifische Deletion von Bmal1 , einer der Kern-zirkadianen Taktkomponenten , zu einer Insulinresistenz und einer verminderten Glukoseaufnahme im Skelettmuskel, und die Tiere wurden gefunden, um Typ-2-Diabetes 7 zu entwickeln . ichNeben der Skelettmuskulatur wird auch zunehmend ein endokrines Organ 8 geschätzt, das Myokine sekretiert, um den systemischen Stoffwechsel und die Physiologie zu regulieren. Mechanistische Studien sind erforderlich, um diese regulatorischen Funktionen im Skelettmuskel vollständig zu verstehen.
ChIP ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Abgrenzung der Promotorrekrutierung von DNA-bindenden Proteinen. ChIP wurde ursprünglich entwickelt, um die Nukleosomenorganisation auf Chromatin-DNA 9 , 10 zu identifizieren. Es wurde bisher eine Vielzahl von Verfahren zur Vernetzung von Proteinen und Chromatin-DNA unter Verwendung von Formaldehyd, Dimethylsulfat oder Ultraviolettbestrahlung (UV) 11 , 12 beschrieben . Die Formaldehyd-Vernetzung ist die am häufigsten verwendete, konservierende Chromatinstruktur und DNA-Protein-Wechselwirkungen 9 , 13 , 14 . Vernetztes ChromatIn wird durch Beschallung zerkleinert und mit Antikörper gegen das jeweilige DNA-bindende Protein von Interesse 15 , 16 immunpräzipitiert. In den letzten Jahren wurde die ChIP-Sequenzierung (ChIP-seq), eine Methode, die ChIP mit NGS kombiniert, entwickelt, um die genomweite Transkriptionsfaktorbindung 17 zu untersuchen und in einigen Fällen die dynamischen Veränderungen über einen Zeitverlauf 18 , 19 , 20 zu überwachen . Zum Beispiel haben zirkadiane ChIP-seq-Studien eine hochorchestrierte Sequenz der genomischen Bindung von zirkadianen Taktkomponenten und Histonmarkern, die eine zeitlich präzise Genexpression während des gesamten 24h-zirkadischen Zyklus 18 antreibt.
Die meisten verfügbaren ChIP-Protokolle sind für Weichgewebe ( zB Leber, Gehirn, etc. ) konzipiert, und nur sehr wenige wurden für harte Gewebe einschließlich Skele veröffentlichtTal muskel Es ist technisch anspruchsvoll, den faserreichen Skelettmuskel zu homogenisieren und die hochwertigen Kerne 21 zu isolieren, insbesondere für ChIP-Experimente, die eine Vernetzung erfordern. In einer neueren Muskel-ChIP-Studie 22 wurden Satelliten-Zellen von Myofasern getrennt, und die Kerne wurden aus beiden Zelltypen durch ein verlängertes Verfahren mit Gewebeverdauung hergestellt. Der gesamte Prozeß dauerte etwa drei Stunden, bis die Formaldehyd-Vernetzung an isolierten Kernen durchgeführt wurde. Während dieses Verfahren eine vernetzte Muskelfaser vermeidet, die das Muskelgewebe für eine effiziente Homogenisierung noch widerstandsfähiger macht und in der Lage war, qualitativ hochwertige Kerne herzustellen, entsteht die signifikante Zeitverzögerung von der Gewebsansammlung zur Keimvernetzung das Risiko einer veränderten DNA -protein-interaktion Im Gegensatz dazu führten die meisten Studien eine Vernetzung unmittelbar nach der experimentellen Behandlung oder Gewebesammlung durch, um das Echtzeit-DNA-Protei zu erhaltenN Bindung 12 Ein zweiter Nachteil der Kerneisolation vor der Vernetzung besteht darin, dass sie zeitempfindliche Anwendungen wie zirkadiane Probensammlungen ausschließt, die typischerweise in Intervallen von 3 – 4 h auftreten. Ohne Vernetzung der Kerne muss die Isolierung unmittelbar nach der Sezierung erfolgen, während vernetzte Proben nach Beendigung des gesamten Zeitverlaufs zusammen verarbeitet werden können, so dass eine größere experimentelle Konsistenz gewährleistet ist.
Andere Protokolle für die Kernenisolation aus dem unvernetzten Skelettmuskel wurden ebenfalls berichtet. Zwei Studien beschreiben die Verwendung von Gradienten-Ultrazentrifugation, um Kerne von verbleibenden Myofibrillen und Zelltrümmern 23 , 24 zu trennen. Während die Saccharose- oder Kolloidgradienten-Ultrazentrifugation mit unvernetzten Muskelgeweben wirksam ist, zeigten unsere Experimente, dass nach der Vernetzung die Gradienten-Ultrazentrifugation die Kerne nicht von der Zelle d trennteEbris auf dem gradienten
Wir haben daher ein Verfahren entwickelt, um qualitativ hochwertige Kerne unter Verwendung von vernetzten Maus-Skelettmuskelgeweben zu isolieren. Statt der Gradienten-Ultrazentrifugation haben wir eine serielle Filtrationsmethode entwickelt, um die Kerne effektiv von Trümmern zu trennen. Nach der Ultraschallbehandlung wurden die Chromatinproben erfolgreich für ChIP-Studien angewendet, die ein zirkadianes Muster der BMAL1-Proteinbindung an Ziel-Promotoren zeigten. Unsere Methode kann breit auf verschiedene mechanistische Studien von Muskelgeweben anwendbar sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir eine robuste Methode, bei der vernetzte Skelettmuskelgewebe verwendet wurden, um qualitativ hochwertige Kerne zu isolieren. Eine sequenzielle Filtration wurde durchgeführt, um die Kerne effektiv von Trümmern zu trennen, und die akustische Ultraschall-Energie aus dem schalenförmigen Wandler scherte das Chromatin für die ChIP-Analyse. Die Ergebnisse zeigten eine zirkadiane zeitspezifische Bindung von BMAL1 an Zielpromotoren.
ChIP kann verwendet werden, um Echtzeit-Prot…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Karyn Esser, Nobuya Koike und Noheon Park für hilfsbereite Beratung. Diese Arbeit wurde zum Teil von NIH / NIGMS (R01GM114424) an S.-HY und der Robert A. Welch Foundation (AU-1731) und NIH / NIA (R01AG045828) an ZC unterstützt
Materials
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318-579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
Riferimenti
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