En filtreringsbasert metode for å fremstille kjernekvalitet av høy kvalitet fra tverrbundet skjelettmuskulatur for kromatinimmunutfelling
Summary
Vi presenterer en filtreringsbasert protokoll for å isolere høykvalitets kjerner fra tverrbundet muskelskjelettmuskulatur hvor vi fjernet behovet for ultracentrifugering, noe som gjør det lett å anvende. Vi viser at kromatin fremstilt fra kjernene er egnet for kromatinimmunpresipitasjon og sannsynligvis kromatinimmunpresipitationssekvenseringsstudier.
Abstract
Kromatinimmunutfelling (ChIP) er en kraftig metode for å bestemme proteinbindingen til kromatin-DNA. Fiberrik skjelettmuskulatur har imidlertid vært en utfordring for ChIP på grunn av tekniske vanskeligheter i isolasjon av kjerne av høy kvalitet med minimal forurensning av myofibriller. Tidligere protokoller har forsøkt å rense kjerner før kryssbinding, noe som medfører risikoen for endret DNA-proteininteraksjon under den langvarige kjernepreparasjonsprosessen. I den nåværende protokollen krysset vi først skjelettmuskulaturvevet oppsamlet fra mus, og vevene ble hakket og sonikert. Siden vi fant at ultracentrifugering ikke var i stand til å separere kjerner fra myofibriller ved å bruke tverrbundet muskelvev, utviklet vi en sekventiell filtreringsprosedyre for å oppnå kvalitetskjerner uten betydelig myofibrilforurensning. Vi forberedte deretter kromatin ved å bruke en ultralydator, og ChIP-analyser med anti-BMAL1-antistoff avslørte robust sirkadisk bindingMønster av BMAL1 for å målrette genpromotorer. Denne filtreringsprotokollen utgjør en lett anvendelig metode for å isolere høykvalitets kjerner fra tverrbundet skjelettmuskulaturvev, slik at konsistent prosessbehandling for sirkadian og andre tidsfølsomme studier blir mulig. I kombinasjon med neste generasjons sekvensering (NGS) kan vår metode bli distribuert for ulike mekaniske og genomiske studier med fokus på skjelettmuskulaturfunksjon.
Introduction
Skeletmuskulaturen spiller viktige roller i fysiologi og oppførsel. Den multikernerte muskelfibre består av myofibriller hvor aktin og myosin danner funksjonelle enheter kalt sarkomerer for å generere kontraktilitet. Skjelettmuskulatur er også det største metabolske organet i kroppen, og står for> 80% postprandial glukoseinntak og regulerer insulinrespons og metabolisk homeostase 1 , 2 . Muskelfysiologi og metabolisme er nøye regulert av sirkadisk klokke, en egen biologisk tidsur 3 , 4 , 5 , 6 . For eksempel resulterte den skjelettmuskelspecifikke deletjonen av Bmal1 , en av kjernens sirkadiske klokomponenter , til insulinresistens og redusert glukoseopptak i skjelettmuskulaturen, og dyrene ble funnet å utvikle type 2-diabetes 7 . JegN tillegg blir skjelettmuskulaturen i stigende grad verdsatt som et endokrin organ 8 , som utskiller myokiner for å regulere systemisk metabolisme og fysiologi. Mekanistiske studier er nødvendig for å forstå disse regulatoriske funksjonene i skjelettmuskulaturen fullt ut.
ChIP er en kraftig tilnærming til å avgrense promotorrekruttering av DNA-bindingsproteiner. ChIP ble opprinnelig utviklet for å identifisere nukleosom organisasjon på kromatin DNA 9 , 10 . En rekke metoder har siden blitt rapportert til tverrbindingsproteiner og kromatin-DNA ved bruk av formaldehyd, dimetylsulfat eller ultraviolett bestråling (UV) 11 , 12 . Formaldehyd-kryssbinding er den mest brukte, konserverende kromatinstrukturen og DNA-protein-interaksjonene 9 , 13 , 14 . Tverrbundet kromatografiIn blir revet av sonikering og immunutfellet med antistoff mot det spesielle DNA-bindende protein av interesse 15 , 16 . I de senere år har ChIP-sekvensering (ChIP-seq), en metode kombinert med ChIP med NGS, blitt utviklet for å forhøre genomfattende transkripsjonsfaktorbinding 17 og i noen tilfeller for å overvåke dynamiske endringer over et tidsforløp 18 , 19 , 20 . For eksempel har sirkidiske ChIP-seq-studier avslørt en svært orkestrert sekvens av genomisk binding av sirkadiske klokomponenter og histon-markører, som driver temporært nøyaktig genuttrykk gjennom hele 24-timers sirkadisk syklus 18 .
De fleste tilgjengelige ChIP-protokoller er laget for myke vev ( f.eks. Lever, hjerne, etc. ), og svært få har blitt publisert for hardt vev inkludert skeleTal muskler. Det er teknisk utfordrende å homogenisere fiberrik skjelettmuskulatur og isolere høykvalitets kjerner 21 , spesielt for ChIP-eksperimenter som krever kryssbinding. I en nylig muskel-ChIP-studie 22 ble satellittceller separert fra myofibere, og kjerner ble fremstilt fra begge celletyper gjennom en forlenget prosedyre som involverer vevsfordøyelse. Hele prosessen tok omtrent tre timer å fullføre før formaldehyd-kryssbinding ble utført på isolerte kjerner. Mens denne prosedyren unngikk å krysse sammen muskelvev, noe som gjør muskelvevet enda mer ildfast mot effektiv homogenisering, og var i stand til å produsere høykvalitets kjerner, forårsaker den betydelige tidsforsinkelsen fra vevsinnsamling til kjerne-kryssbinding risikoen for endret DNA -proteininteraksjon. I motsetning til dette utførte de fleste studier kryssbinding umiddelbart etter eksperimentell behandling eller vevsinnsamling for å bevare sanntids DNA-proteiN bindende 12 . En annen ulempe ved kjerneisolasjon før kryssbinding er at den utelukker tidsfølsomme applikasjoner som sirkadisk prøveinnsamling som vanligvis forekommer i intervaller på 3-4 timer. Uten å koble sammen kjernene, trenger isolasjonen umiddelbart etter disseksjon, mens kryssbundne prøver kan behandles sammen etter at hele tidskurset er fullført, og dermed sikrer større eksperimentell konsistens.
Andre protokoller for kjerneisolasjon fra ukrosslinket skjelettmuskulatur har også blitt rapportert. To studier beskrev bruken av gradient-ultracentrifugering for å separere kjerner fra gjenværende myofibriller og celleavfall 23 , 24 . Selv om sukrose eller kolloidal gradient ultracentrifugering er effektiv med ukrossamlede muskelvev, viste våre eksperimenter at etter kryssbinding mislyktes gradient ultracentrifugering til å adskille kjerner fra celle dEbris på gradienten.
Vi utviklet derfor en prosedyre for å isolere høykvalitets kjerner ved å bruke tverrbundne muskelskjelettmuskler. I stedet for gradient ultracentrifugering, utviklet vi en seriefiltreringsmetode for effektivt å separere kjerner fra rusk. Etter ultralydbehandling ble kromatinprøvene anvendt med suksess for ChIP-studier som viste et sirkadisk mønster av BMAL1-proteinbinding til målpromotorer. Vår metode kan være bredt anvendelig for ulike mekanistiske studier av muskelvev.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en robust metode der tverrbundet skjelettmuskulatur vev ble brukt til å isolere høykvalitets kjerner. Sekventiell filtrering ble utført for effektivt å separere kjerner fra rusk, og ultralydsakustisk energi fra skålformet transduktor skåret kromatinet for ChIP-analyse. Resultatene viste circadian tidspesifik binding av BMAL1 til målpromotorer.
ChIP kan brukes til å fange sanntids proteinbelegning på genomisk DNA når kryssbinding foregår. For å dra nytte av dette …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Karyn Esser, Nobuya Koike og Noheon Park for nyttige råd. Dette arbeidet ble delvis støttet av NIH / NIGMS (R01GM114424) til S.-HY, og Robert A. Welch Foundation (AU-1731) og NIH / NIA (R01AG045828) til ZC
Materials
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318-579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
Riferimenti
- Bouzakri, K., et al. siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle. Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. The meter of metabolism. Cell. 134 (5), 728-742 (2008).
- Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat Chem Biol. 3 (10), 630-639 (2007).
- Harfmann, B. D., Schroder, E. A., Esser, K. A. Circadian rhythms, the molecular clock, and skeletal muscle. J Biol Rhythms. 30 (2), 84-94 (2015).
- Nohara, K., Yoo, S. H., Chen, Z. J. Manipulating the circadian and sleep cycles to protect against metabolic disease. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 35 (2015).
- Harfmann, B. D., et al. Muscle-specific loss of Bmal1 leads to disrupted tissue glucose metabolism and systemic glucose homeostasis. Skelet Muscle. 6, 12 (2016).
- Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Jackson, V. Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent. Cell. 15 (3), 945-954 (1978).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Takahashi, J. S., et al. ChIP-seq and RNA-seq methods to study circadian control of transcription in mammals. Methods Enzymol. 551, 285-321 (2015).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Chen, Z., Manley, J. L. Core promoter elements and TAFs contribute to the diversity of transcriptional activation in vertebrates. Mol Cell Biol. 23 (20), 7350-7362 (2003).
- Menet, J. S., Abruzzi, K. C., Desrochers, J., Rodriguez, J., Rosbash, M. Dynamic PER repression mechanisms in the Drosophila circadian clock: from on-DNA to off-DNA. Genes Dev. 24 (4), 358-367 (2010).
- Miki, T., Matsumoto, T., Zhao, Z., Lee, C. C. p53 regulates Period2 expression and the circadian clock. Nat Commun. 4, 2444 (2013).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Koike, N., et al. Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals. Science. 338 (6105), 349-354 (2012).
- Zhou, J., Yu, W., Hardin, P. E. ChIPping away at the Drosophila clock. Methods Enzymol. 551, 323-347 (2015).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. , (2016).
- Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. Isolation of skeletal muscle nuclei. J Cell Biol. 27 (2), 365-377 (1965).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Isolation of nuclei from skeletal muscle satellite cells and myofibers for use in chromatin immunoprecipitation assays. Methods Mol Biol. 798, 517-530 (2012).
- Wilkie, G. S., Schirmer, E. C. Purification of nuclei and preparation of nuclear envelopes from skeletal muscle. Methods Mol Biol. 463, 23-41 (2008).
- Hahn, C. G., Covault, J. Isolation of transcriptionally active nuclei from striated muscle using Percoll density gradients. Anal Biochem. 190 (2), 193-197 (1990).
- Jeong, K., et al. Dual attenuation of proteasomal and autophagic BMAL1 degradation in Clock Delta19/+ mice contributes to improved glucose homeostasis. Scientific reports. 5, 12801 (2015).
- Nohara, K., et al. Ammonia-lowering activities and carbamoyl phosphate synthetase 1 (Cps1) induction mechanism of a natural flavonoid. Nutrition & metabolism. 12, 23 (2015).
- Zhang, L., Rubins, N. E., Ahima, R. S., Greenbaum, L. E., Kaestner, K. H. Foxa2 integrates the transcriptional response of the hepatocyte to fasting. Cell Metab. 2 (2), 141-148 (2005).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
- Kondratov, R. V., et al. BMAL1-dependent circadian oscillation of nuclear CLOCK: posttranslational events induced by dimerization of transcriptional activators of the mammalian clock system. Genes Dev. 17 (15), 1921-1932 (2003).
- Ripperger, J. A., Schibler, U. Rhythmic CLOCK-BMAL1 binding to multiple E-box motifs drives circadian Dbp transcription and chromatin transitions. Nat Genet. 38 (3), 369-374 (2006).
- Laplante, M., et al. DEPTOR cell-autonomously promotes adipogenesis, and its expression is associated with obesity. Cell Metab. 16 (2), 202-212 (2012).
- Blechman, J., Amir-Zilberstein, L., Gutnick, A., Ben-Dor, S., Levkowitz, G. The metabolic regulator PGC-1alpha directly controls the expression of the hypothalamic neuropeptide oxytocin. J Neurosci. 31 (42), 14835-14840 (2011).
