Un metodo basato sulla filtrazione per preparare nuclei di alta qualità dal muscolo scheletrico incrociato per l'immunoprecipitazione cromatina

Sommario

Presentiamo un protocollo basato sulla filtrazione per isolare nuclei di alta qualità dal muscolo scheletrico del mouse a croce, in cui abbiamo rimosso la necessità di ultracentrifugazione, rendendola facilmente applicabile. Mostriamo che la cromatina preparata dai nuclei è adatta per l'immunoprecipitazione di cromatina e probabilmente gli studi di sequenza di immunoprecipitazione cromatina.

Abstract

L'immunoprecipitazione cromatina (ChIP) è un metodo potente per determinare la legame delle proteine ​​al DNA cromatina. Il muscolo scheletrico ricco di fibre, tuttavia, è stato una sfida per ChIP a causa di difficoltà tecniche in isolamento di nuclei di alta qualità con minima contaminazione dei miofibri. I protocolli precedenti hanno tentato di purificare i nuclei prima di incrociare, il che comporta il rischio di alterazione dell'interazione tra proteine ​​del DNA durante il prolungato processo di preparazione del nucleo. Nel protocollo attuale, abbiamo prima incrociato il tessuto muscolare scheletrico raccolto dai topi, ei tessuti vennero macinati e sottoposti a sonicazione. Dal momento che abbiamo scoperto che l'ultracentrifugazione non era in grado di separare i nuclei dai miofibri usando tessuti muscolari reticolati, abbiamo elaborato una procedura di filtrazione sequenziale per ottenere nuclei di alta qualità privi di contaminazione myofibra significativa. Successivamente abbiamo preparato la cromatina usando un ultrasonicator, e i test di ChIP con anti-BMAL1 anticorpo hanno rivelato robusto legame circadianoPattern di BMAL1 a destinare i promotori del gene. Questo protocollo di filtrazione costituisce un metodo facilmente applicabile per isolare nuclei di alta qualità dal tessuto muscolare scheletrico reticolato, consentendo un'elaborazione costante del campione per studi circadiani e altri sensibili ai tempi. In combinazione con sequenziamento di nuova generazione (NGS), il nostro metodo può essere impiegato per vari studi meccanici e genomici incentrati sulla funzione muscolare scheletrica.

Introduzione

Il muscolo scheletrico gioca un ruolo importante nella fisiologia e nel comportamento. La fibra muscolare multi-nucleata è costituita da miofibri in cui l'actina e la myosina formano unità funzionali chiamate sarcomeri per generare forza contrattile. Il muscolo scheletrico è anche il più grande organo metabolico del corpo, che rappresenta l'assunzione postprandiale del glucosio> 80% e regola la risposta dell'insulina e l'omeostasi metabolica ^{1 , 2} . La fisiologia muscolare e il metabolismo sono strettamente regolamentati dall'orologio circadian, un timer biologico intrinseco

Protocollo

La cura degli animali è stata eseguita in base alle linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali (IACUC) e le procedure sono state condotte secondo un protocollo animale approvato dall'Università del Texas Health Science Center di Houston.

1. Isolamento delle nuclei dal muscolo scheletrico incrociato

1. Pesare e schiacciare i muscoli scheletrici degli arti posteriori, isolati da topi maschii C57BL / 6 di circa 20 settimane, in salina fosfata tamponata ghiacciata (PBS) come descritto dettagliatamente in precedenza ²² .
   NOTA: di solito ottieniamo 1,0 - 1,5 g di muscolo scheletric....

Risultati

Qui abbiamo eseguito cross-linking di formaldeide immediatamente dopo la raccolta dei tessuti per preservare l'interazione di DNA-proteine ​​in tempo reale. Tuttavia, abbiamo rilevato che il gradiente di saccarosio o colloidale, comunemente usato per l'isolamento del nucleo ^{23 , 24} , non era efficace nel separare i nuclei dai miofibri (dati non mostrati). La ragione può essere che la reticolazione conferisse una gravità s.......

Discussione

Qui descriviamo un metodo robusto dove i tessuti muscolari scheletrici reticolati sono stati utilizzati per isolare nuclei di alta qualità. La filtrazione sequenziale è stata effettuata per separare efficacemente i nuclei dai detriti e l'energia acustica ultrasonica dal trasduttore a forma di piatto ha tagliato la cromatina per l'analisi ChIP. I risultati hanno mostrato la correlazione temporale circadiana del BMAL1 ai promotori target.

ChIP può essere impiegato per catturare l'o.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Materiali
Soluzione di formaldeide	Sigma Aldrich	F8775
Glycine	Fisher Scientific	BP381-5
Soluzione di blu di tripano (0,4%)	Fisher Scientific	15250061
RNasi A	Sigma Aldrich	10109142001
Proteasi K	Sigma Aldrich	3115887001
Anticorpo anti-BMAL1			di polloGenerato nel pollo (Cocalico Biologicals) contro l'antigene aa 318 - 579, e le IgY sono state purificate per affinità utilizzando lo stesso antigene.
Resina precipitante IgY di pollo	GenScript	L00405
Equipment
KINEMATICA  Polytron PT2100 Omogeneizzatore da banco	Fisher Scientific	08-451-178
15 mL Dounce macina tessuti	Whearton	357544
Falcon Cell Strainers 100 &; m	Fisher Scientific	08-771-19
Filtri per cellule di falco 70 µ m	Fisher Scientific	08-771-1
Filtri per cellulari di falco 40 µ m	Fisher Scientific	08-771-2
pluriFiltro 30 µ m	PluriSelect	43-50030-03
pluriStrainer 20 µ m	PluriSelect	43-50020-03
pluriFiltro 10 µ m	PluriSelect	43-50010-03
Covaris S2 Ultrasuoni focalizzati	Covaris	Modello S2
Labquake	Thermo Scientific	C415110
Fotocamera per microscopio CCD	Leica Microsystems	DFC3000
Kit di estrazione del DNA	Thermo Scientific	K0691
Buffers
Tutti i componenti del tampone sono descritti nel protocollo. Ogni componente è stato acquistato da Sigma Aldrich

Kit di reagenti G