Un método basado en la filtración para preparar núcleos de alta calidad a partir de músculo esquelético reticulado para inmunoprecipitación de cromatina
Summary
Presentamos un protocolo basado en la filtración para aislar núcleos de alta calidad a partir de músculo esquelético de ratón reticulado en el que eliminamos la necesidad de ultracentrifugación, haciéndolo fácilmente aplicable. Mostramos que la cromatina preparada a partir de los núcleos es adecuada para la inmunoprecipitación de la cromatina y probables estudios de secuenciación con inmunoprecipitación de la cromatina.
Abstract
La inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) es un poderoso método para determinar la unión de proteínas al ADN de la cromatina. Sin embargo, el músculo esquelético rico en fibra ha sido un desafío para ChIP debido a la dificultad técnica en el aislamiento de núcleos de alta calidad con mínima contaminación de miofibrillas. Los protocolos anteriores han intentado purificar los núcleos antes de la reticulación, lo que entraña el riesgo de alteración de la interacción ADN-proteína durante el proceso de preparación prolongada de los núcleos. En el protocolo actual, primero se reticuló el tejido muscular esquelético recogido de ratones, y los tejidos fueron picados y sonicated. Dado que se encontró que la ultracentrifugación no era capaz de separar los núcleos de las miofibrillas utilizando tejido muscular reticulado, se ideó un procedimiento de filtración secuencial para obtener núcleos de alta calidad carentes de contaminación significativa de miofibrillas. Posteriormente se preparó la cromatina mediante el uso de un ultrasonista, y los ensayos de ChIP con anticuerpo anti-BMAL1 reveló fuerte vinculación circadianaPatrón de BMAL1 a los promotores de genes de destino. Este protocolo de filtración constituye un método fácilmente aplicable para aislar núcleos de alta calidad a partir de tejidos de músculo esquelético entrecruzados, permitiendo un procesamiento consistente de muestras para estudios circadianos y otros estudios sensibles al tiempo. En combinación con la secuenciación de próxima generación (NGS), nuestro método puede desplegarse para varios estudios mecánicos y genómicos centrados en la función del músculo esquelético.
Introduction
El músculo esquelético juega un papel importante en la fisiología y el comportamiento. La fibra muscular multi-nucleada consiste en miofibrillas donde la actina y la miosina forman unidades funcionales llamadas sarcómeros para generar fuerza contráctil. El músculo esquelético es también el órgano metabólico más grande del cuerpo, que representa> 80% de la ingesta postprandial de glucosa y la regulación de la respuesta insulínica y la homeostasis metabólica 1 , 2 . La fisiología y el metabolismo muscular están estrechamente regulados por el reloj circadiano, un temporizador biológico intrínseco 3 , 4 , 5 , 6 . Por ejemplo, la deleción específica del músculo esquelético de Bmal1 , uno de los componentes del reloj circadiano núcleo, resultó en la resistencia a la insulina y disminución de la captación de glucosa en el músculo esquelético, y los animales se descubrió desarrollar diabetes tipo 2 [ 7] . yoAdemás, el músculo esquelético también se aprecia cada vez más como un órgano endocrino 8 , secretando mioquinas para regular el metabolismo sistémico y la fisiología. Se requieren estudios mecánicos para entender completamente estas funciones reguladoras en el músculo esquelético.
ChIP es un poderoso enfoque para delinear el reclutamiento del promotor de las proteínas de unión al ADN. ChIP se desarrolló inicialmente para identificar la organización de los nucleosomas en cromatina ADN [ 9 , 10] . Desde entonces, se ha informado de una variedad de métodos para reticular proteínas y ADN de cromatina usando formaldehído, sulfato de dimetilo o irradiación ultravioleta (UV) 11 , 12 . El entrecruzamiento del formaldehído es el más comúnmente utilizado, conservando la estructura de la cromatina y las interacciones ADN-proteína 9 , 13 , 14 . Cromatografía reticuladaEn es desmenuzado por sonicación e inmunoprecipitado con anticuerpo contra la proteína de unión al ADN particular de interés 15 , 16 . En los últimos años se ha desarrollado la secuenciación de ChIP (ChIP-seq), un método que combina ChIP con NGS, para interrogar la unión del factor de transcripción del genoma 17 y, en algunos casos, para monitorear los cambios dinámicos a lo largo del tiempo 18 , 19 , 20 . Por ejemplo, los estudios circadianos de ChIP-seq han revelado una secuencia altamente orquestada de unión genómica de componentes de reloj circadiano y marcadores de histonas, que impulsa la expresión de genes temporalmente precisa durante todo el ciclo circadiano de ~ 24 h [ 18] .
La mayoría de los protocolos disponibles de ChIP están diseñados para tejidos blandos ( por ejemplo , hígado, cerebro, etc. ), y muy pocos han sido publicados para tejidos duros incluyendo el esqueletoTal músculo. Es técnicamente difícil homogeneizar músculo esquelético rico en fibra y aislar núcleos de alta calidad [ 21] , especialmente para los experimentos de ChIP que requieren reticulación. En un reciente estudio de ChIP muscular 22 , las células satélite se separaron de las miofibras, y los núcleos se prepararon a partir de ambos tipos de células a través de un procedimiento prolongado que implica la digestión de los tejidos. El proceso completo tardó aproximadamente tres horas en completarse antes de que se realizara reticulación de formaldehído en núcleos aislados. Si bien este procedimiento evitó el entrecruzamiento de la fibra muscular, lo que hace que el tejido muscular sea aún más refractario a la homogeneización eficiente, y fue capaz de producir núcleos de alta calidad, el importante tiempo transcurrido desde la recolección de tejidos hasta la reticulación de núcleos incurre en el riesgo de alteración del ADN -proteína. Por el contrario, la mayoría de los estudios realizaron reticulación inmediatamente después del tratamiento experimental o recolección de tejidos con el fin de preservar el ADN en tiempo realN de unión 12 . Un segundo inconveniente del aislamiento de núcleos antes de la reticulación es que impide aplicaciones sensibles al tiempo tales como la recolección circadiana de muestras que típicamente ocurre a intervalos de 3 – 4 h. Sin la reticulación de los núcleos, el aislamiento debe proceder inmediatamente después de la disección, mientras que las muestras reticuladas pueden ser procesados juntos después de todo el curso del tiempo se ha completado, lo que garantiza una mayor consistencia experimental.
También se han descrito otros protocolos para el aislamiento de núcleos a partir de músculo esquelético no reticulado. Dos estudios describieron el uso de la ultracentrifugación gradiente para separar los núcleos de las restantes miofibrillas y restos celulares 23 , 24 . Mientras que la sacarosa o la ultracentrifugación con gradiente coloidal es eficaz con tejidos musculares no reticulados, nuestros experimentos revelaron que después de la reticulación, la ultracentrifugación en gradiente falló al separar los núcleos de la célula dEbris en el gradiente.
Por lo tanto, desarrolló un procedimiento para aislar núcleos de alta calidad utilizando tejidos de músculo esquelético de ratón reticulado. En lugar de la ultracentrifugación gradiente, hemos ideado un método de filtración en serie para separar eficazmente los núcleos de los desechos. Después de la ultrasonicación, las muestras de cromatina se aplicaron con éxito para los estudios ChIP que mostró un patrón circadiano de la proteína BMAL1 vinculante a los promotores objetivo. Nuestro método puede ser ampliamente aplicable a varios estudios mecanicistas de los tejidos musculares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos un método robusto en el que se utilizaron tejidos de músculo esquelético entrecruzados para aislar núcleos de alta calidad. La filtración secuencial se llevó a cabo para separar eficazmente los núcleos de los residuos, y la energía acústica ultrasónica del transductor en forma de plato cizalló la cromatina para el análisis de ChIP. Los resultados mostraron que el tiempo circadiano específico de unión de BMAL1 a los promotores objetivo.
ChIP se puede emplear pa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Karyn Esser, Nobuya Koike y Noheon Park por sus consejos útiles. Este trabajo fue apoyado en parte por NIH / NIGMS (R01GM114424) a S.-HY, y la Fundación Robert A. Welch (AU-1731) y NIH / NIA (R01AG045828) a ZC
Materials
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318-579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
Riferimenti
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