En filtreringsbaserad metod för att förbereda högkvalitativ nukleär från tvärbunden skelettmuskel för kromatinimmunutfällning
Summary
Vi presenterar ett filtreringsbaserat protokoll för att isolera högkvalitativa kärnor från tvärbunden muskelskelettmuskel, där vi avlägsnade behovet av ultracentrifugering, vilket gör det lätt att använda. Vi visar att kromatin framställt från kärnorna är lämplig för kromatinimmunutfällning och sannolikt kromatinimmunutfällnings-sekvenseringsstudier.
Abstract
Kromatinimmunutfällning (ChIP) är en kraftfull metod för att bestämma proteinbindning till kromatin-DNA. Fiberrik skelettmuskel har dock varit en utmaning för ChIP på grund av tekniska svårigheter i isolering av högkvalitativa kärnor med minimal förorening av myofibriller. Tidigare protokoll har försökt att rena kärnor före tvärbindning, vilket medför risken för förändrad DNA-proteininteraktion under det långvariga kärnberedningsförfarandet. I det nuvarande protokollet korsade vi först skelettmuskulaturvävnaden uppsamlad från möss och vävnaderna hakades och sonikerades. Eftersom vi fann att ultracentrifugering inte kunde separera kärnor från myofibriller med användning av tvärbunden muskelvävnad, utformade vi en sekventiell filtreringsprocedur för att erhålla högkvalitativa kärnor utan betydande myofibrilförorening. Vi framställde därefter kromatin genom användning av en ultraljudsapparat, och ChIP-analyser med anti-BMALl-antikropp avslöjade robust cirkadisk bindningMönster av BMAL1 till målgenpromotorer. Detta filtreringsprotokoll utgör en lättanvänd metod för att isolera högkvalitativa kärnor från tvärbunden skelettmuskelvävnad, vilket möjliggör konsekvent provbehandling för cirkadian och andra tidskänsliga studier. I kombination med nästa generations sekvensering (NGS) kan vår metod användas för olika mekaniska och genomiska studier med inriktning på skelettmuskelfunktion.
Introduction
Skelettmuskel spelar viktiga roller i fysiologi och beteende. Den flerkärniga muskelfibern består av myofibriller där aktin och myosin bildar funktionella enheter som kallas sarkomerer för att generera kontraktil kraft. Skelettmuskel är också det största metabola organet i kroppen, som står för> 80% postprandial glukosintag och reglerar insulinreaktion och metabolisk homeostas 1 , 2 . Muskelfysiologi och ämnesomsättning är nära reglerad av cirkadian klockan, en inneboende biologisk timer 3 , 4 , 5 , 6 . Exempelvis resulterade den skelettmuskelspecifika deletionen av Bmal1 , en av de kärna cirkadiska klockkomponenterna, i insulinresistens och minskad glukosupptagning i skelettmuskulaturen, och djuren visade sig utveckla typ 2-diabetes 7 . jagN tillägg skelettmuskel blir också alltmer uppskattat som ett endokrin organ 8 , som utsöndrar myokiner för att reglera systemisk metabolism och fysiologi. Mekanistiska studier krävs för att fullständigt förstå dessa regleringsfunktioner i skelettmuskeln.
ChIP är ett kraftfullt sätt att avgränsa promotorrekrytering av DNA-bindande proteiner. ChIP utvecklades initialt för att identifiera nukleosomorganisationen på kromatin-DNA 9 , 10 . En rad olika metoder har sedan rapporterats till tvärbindningsproteiner och kromatin-DNA med användning av formaldehyd, dimetylsulfat eller ultraviolett bestrålning (UV) 11 , 12 . Formaldehyd-tvärbindning är den vanligaste, konserverande kromatinstrukturen och DNA-protein-interaktionerna 9 , 13 , 14 . Tvärbunden kromatografiIn sönderdelas genom sonikering och immunutfälls med antikropp mot det specifika DNA-bindande proteinet av intresse 15 , 16 . Under de senaste åren har ChIP-sekvensering (ChIP-seq), en metod som kombinerar ChIP med NGS, utvecklats för att förhöra genombrett transkriptionsfaktorbindning 17 och i vissa fall för att övervaka dynamiska förändringar över en tidskurs 18 , 19 , 20 . Exempelvis har cirkidiska ChIP-seq-studier avslöjat en starkt orkestrerad sekvens av genomisk bindning av cirkadiska klockkomponenter och histonmarkörer, som driver temporärt precist genuttryck under hela 24 h cirkadiancykeln 18 .
De flesta tillgängliga ChIP-protokoll är utformade för mjukvävnad (t ex lever, hjärna etc. ), och väldigt få har publicerats för hårda vävnader inklusive skeleTalmuskel. Det är tekniskt utmanande att homogenisera fiberrik skelettmuskel och isolera högkvalitativa kärnor 21 , speciellt för ChIP-experiment som kräver tvärbindning. I en nyligen genomförd muskel-ChIP-studie 22 separerades satellitceller från myofibrer, och kärnor framställdes från båda celltyperna genom en långvarig procedur som involverade vävnadsdigestion. Hela processen tog ungefär tre timmar att slutföra innan formaldehyd-tvärbindning utfördes på isolerade kärnor. Även om detta förfarande undviker tvärbindning av muskelfibrer, vilket gör muskelvävnaden ännu mer eldfast mot effektiv homogenisering och kunde producera högkvalitativa kärnor, innebär den signifikanta tidsfördröjningen från vävnadssamling till kärnbindning att risken för förändrat DNA -proteininteraktion. Däremot utförde de flesta studierna tvärbindning omedelbart efter experimentell behandling eller vävnadssamling för att bevara realtids DNA-proteiN-bindning 12 . En andra nackdel med kärnorisolering före tvärbindning är att den utesluter tidskänsliga tillämpningar såsom cirkadisk samling av prov som vanligtvis förekommer med mellanrum på 3 – 4 timmar. Utan tvärbindning av kärnorna behöver isoleringen fortgå omedelbart efter dissektion, medan tvärbundna prover kan bearbetas tillsammans efter att hela tidskursen är klar och därigenom säkerställer större experimentell konsistens.
Andra protokoll för kärnisolering från okrossbunden skelettmuskel har också rapporterats. Två studier beskrev användningen av gradient ultracentrifugering för att separera kärnor från kvarvarande myofibriller och cellrester 23 , 24 . Medan sackaros eller kolloidal gradient ultracentrifugering är effektiv med icke tvärbundna muskelvävnader, visade våra experiment att efter tvärbindning misslyckades gradient ultracentrifugering att separera kärnor från cell dEbris på gradienten.
Vi utvecklade därför ett förfarande för att isolera högkvalitativa kärnor med hjälp av tvärbundna muskelvävnader från muskelskelett. I stället för gradient ultracentrifugering utformade vi en seriefiltreringsmetod för att effektivt separera kärnor från skräp. Efter ultraljud användes kromatinproverna framgångsrikt för ChIP-studier som visade ett cirkadiskt mönster av BMALl-proteinbindning till målpromotorer. Vår metod kan i stor utsträckning tillämpas på olika mekanistiska studier av muskelvävnader.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi en robust metod där tvärbundna skelettmuskelvävnader användes för att isolera högkvalitativa kärnor. Sekventiell filtrering utfördes för att effektivt separera kärnor från skräp och ultraljudsakustisk energi från skålformad omvandlare skjuvade kromatinet för ChIP-analys. Resultaten visade cirkadisk tidsspecifik bindning av BMAL1 till målpromotorer.
ChIP kan användas för att fånga realtids proteinbeläggning på genomiskt DNA när tvärbindning sker. För …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Karyn Esser, Nobuya Koike och Noheon Park för användbara råd. Detta arbete stöddes delvis av NIH / NIGMS (R01GM114424) till S.-HY och Robert A. Welch Foundation (AU-1731) och NIH / NIA (R01AG045828) till ZC
Materials
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318-579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
Riferimenti
- Bouzakri, K., et al. siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle. Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. The meter of metabolism. Cell. 134 (5), 728-742 (2008).
- Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat Chem Biol. 3 (10), 630-639 (2007).
- Harfmann, B. D., Schroder, E. A., Esser, K. A. Circadian rhythms, the molecular clock, and skeletal muscle. J Biol Rhythms. 30 (2), 84-94 (2015).
- Nohara, K., Yoo, S. H., Chen, Z. J. Manipulating the circadian and sleep cycles to protect against metabolic disease. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 35 (2015).
- Harfmann, B. D., et al. Muscle-specific loss of Bmal1 leads to disrupted tissue glucose metabolism and systemic glucose homeostasis. Skelet Muscle. 6, 12 (2016).
- Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Jackson, V. Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent. Cell. 15 (3), 945-954 (1978).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Takahashi, J. S., et al. ChIP-seq and RNA-seq methods to study circadian control of transcription in mammals. Methods Enzymol. 551, 285-321 (2015).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Chen, Z., Manley, J. L. Core promoter elements and TAFs contribute to the diversity of transcriptional activation in vertebrates. Mol Cell Biol. 23 (20), 7350-7362 (2003).
- Menet, J. S., Abruzzi, K. C., Desrochers, J., Rodriguez, J., Rosbash, M. Dynamic PER repression mechanisms in the Drosophila circadian clock: from on-DNA to off-DNA. Genes Dev. 24 (4), 358-367 (2010).
- Miki, T., Matsumoto, T., Zhao, Z., Lee, C. C. p53 regulates Period2 expression and the circadian clock. Nat Commun. 4, 2444 (2013).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Koike, N., et al. Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals. Science. 338 (6105), 349-354 (2012).
- Zhou, J., Yu, W., Hardin, P. E. ChIPping away at the Drosophila clock. Methods Enzymol. 551, 323-347 (2015).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. , (2016).
- Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. Isolation of skeletal muscle nuclei. J Cell Biol. 27 (2), 365-377 (1965).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Isolation of nuclei from skeletal muscle satellite cells and myofibers for use in chromatin immunoprecipitation assays. Methods Mol Biol. 798, 517-530 (2012).
- Wilkie, G. S., Schirmer, E. C. Purification of nuclei and preparation of nuclear envelopes from skeletal muscle. Methods Mol Biol. 463, 23-41 (2008).
- Hahn, C. G., Covault, J. Isolation of transcriptionally active nuclei from striated muscle using Percoll density gradients. Anal Biochem. 190 (2), 193-197 (1990).
- Jeong, K., et al. Dual attenuation of proteasomal and autophagic BMAL1 degradation in Clock Delta19/+ mice contributes to improved glucose homeostasis. Scientific reports. 5, 12801 (2015).
- Nohara, K., et al. Ammonia-lowering activities and carbamoyl phosphate synthetase 1 (Cps1) induction mechanism of a natural flavonoid. Nutrition & metabolism. 12, 23 (2015).
- Zhang, L., Rubins, N. E., Ahima, R. S., Greenbaum, L. E., Kaestner, K. H. Foxa2 integrates the transcriptional response of the hepatocyte to fasting. Cell Metab. 2 (2), 141-148 (2005).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
- Kondratov, R. V., et al. BMAL1-dependent circadian oscillation of nuclear CLOCK: posttranslational events induced by dimerization of transcriptional activators of the mammalian clock system. Genes Dev. 17 (15), 1921-1932 (2003).
- Ripperger, J. A., Schibler, U. Rhythmic CLOCK-BMAL1 binding to multiple E-box motifs drives circadian Dbp transcription and chromatin transitions. Nat Genet. 38 (3), 369-374 (2006).
- Laplante, M., et al. DEPTOR cell-autonomously promotes adipogenesis, and its expression is associated with obesity. Cell Metab. 16 (2), 202-212 (2012).
- Blechman, J., Amir-Zilberstein, L., Gutnick, A., Ben-Dor, S., Levkowitz, G. The metabolic regulator PGC-1alpha directly controls the expression of the hypothalamic neuropeptide oxytocin. J Neurosci. 31 (42), 14835-14840 (2011).
