Isolering av Endothelial stamceller från mänskliga navelsträngsblod
Summary
Målet med detta protokoll är att isolera endothelial stamceller från navelsträngsblod. Vissa applikationer inkluderar använder dessa celler som en biomarkör för att identifiera patienter med kardiovaskulär risk, behandling av ischemisk sjukdomar, och skapa vävnadstekniska vaskulär och hjärtat ventil konstruerar.
Abstract
Förekomsten av endothelial stamceller (EPC) i perifert blod och sitt engagemang i vasculogenesis rapporterades först av Ashara och kollegor1. Senare, dokumenterade andra förekomsten av liknande typer av EPCs med ursprung från benmärgen2,3. Mer nyligen, Yoder och Ingram visade att EPCs härrör från navelsträngsblod hade en högre proliferativ potential jämfört med sådana isolerade från vuxen perifert blod4,5,6. Förutom att vara involverad i postnatal vasculogenesis, har EPCs också visat löfte som en cell för att skapa vävnadstekniska vaskulär och hjärtat ventil konstruktioner7,8. Olika isolering protokoll finns, av vilka några innebär cell sortering av mononukleära celler (multinationella) härrör från de källor som tidigare nämnts med hjälp av endothelial och hematopoetiska markörer eller odla dessa multinationella företag med specialiserade endothelial tillväxt medium, eller en kombination av dessa tekniker9. Här presenterar vi ett protokoll för isolering och kultur av EPCs använder specialiserade endothelial medium kompletteras med tillväxtfaktorer, utan användning av immunosorting, följt av karakterisering av de isolerade celler med Western blotting och immunfärgning.
Introduction
Flera utredare har studerat egenskaper och potential av mänskliga EPCs5,10,11,12,13. EPCs kan beskrivas som cirkulerande celler som har förmåga att följa endothelial vävnad i platser av syrebrist, ischemi, skada eller tumörbildning och bidra till bildandet av nya vaskulära strukturer4,14. Deras observerade engagemang i kärlnybildning, i form av postnatal vasculogenesis, har lett till en förståelse av patofysiologin av dessa celler och deras användning i terapeutiska tillämpningar4,15, 16. antalet EPCs i en individ har visat sig vara korrelerade med kardiovaskulär patologi9,15,16,17,18,19 ,20. Andra studier har också differentierade EPCs till en ventil fibroblast-liknande fenotyp och föreslagit att dessa celler kan användas för vävnadsteknik hjärta ventiler7,21.
Viss cell surface molekyler behövs för att isolera EPCs inte tydligt har identifierats tack vare diskrepanser mellan utredningar4. Vidhäftningen av multinationella företag till en viss matris, med exponering för en mängd olika odlingsbetingelser, har utförts av flera grupper1,17,22,23, tyder på att förmodad EPCs kan Visa olika fenotypiska egenskaper. Dessa egenskaper omfattar brist phagocytotic förmåga, tube bildande i Matrigel och upptaget av Dil-acetylerade low-density lipoprotein. Den höga clonogenic och proliferativ potentialen är två egenskaper som EPCs kan vara hierarchized5. EPCs kan också bilda in vitro- tubuli när cocultured med mänskliga fostrets lunga fibroblaster4. Dessa celler är kända att Uttrycka endotelceller yta markörer och dela några av de hematopoetiska markörer13,24,25. De positivt uttryckt markörer som är allmänt vedertagna för fenotypning EPCs är CD31, CD34, vaskulär endotelial tillväxtfaktor receptor 2 (VEGFR2), von Willebrands faktor (vWF), CD133, c-Kit och vaskulär endotelial cadherin (VE-cadherin)4 , 18. celler som tillsammans uttrycker CD90, CD45, CD14, CD115 eller alpha-smooth muscle aktin (α-SMA) anses inte vara EPCs på grund av deras begränsade proliferativ potential, förmåga att phagocytose bakterier och oförmåga att bilda de novo mänskliga fartyg i vivo4,7. Denna artikel beskriver ett modifierat protokoll för isolering av endothelial stamceller från mänskliga navelsträngsblod utan behov av någon cell sortering protokoll. Den här artikeln använde vi CD31, CD34 och VEGFR2 som positiva markörer, med α-SMA som negativ indikator.
I denna artikel föreslår vi en metod att isolera och odla endothelial stamceller från navelsträngsblod utan cell sortering använder specialiserade endothelial odlingsmedium kompletteras med tillväxtfaktorer (EGM). Denna extra bolagsstämma innehåller vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) och fibroblast tillväxtfaktor (FGF), som förbättrar överlevnad, spridning och migration av endotelceller26. Det omfattar även askorbinsyra, som är ansvarig för att upprätthålla kullersten morfologi av celler; insulin-liknande tillväxtfaktor-1 (IGF-1), som ger angiogena och flyttande funktion; och heparin, som orsakar förbättrad långsiktig stabilitet av tillväxtfaktorer i den medelstora26. Andra tillväxtfaktorer som tillsätts den endothelial cellodlingsmedium inkluderar tillskott med epidermal tillväxtfaktor (EGF), som hjälper till att stimulera cellproliferation och differentiering och hydrokortison, som väcker intresse cellerna att EGF26 . Vi visar att användningen av denna specifika odlingsmedium ger högre numrerar av EPCs jämfört endothelial basala medium (EBM) eller Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM).
Protocol
Representative Results
Discussion
Som tidigare nämnts, anhängare EPCs besitter en kullersten morfologi. Våra isolerade multinationella företag utvecklats från en spolformad cell koloni (figur 2A-2D) i ett tidigt skede till en kullersten koloni (figur 2E-2F) under en period av tio dagar i kultur. EPCs har märkts på olika sätt av olika forskargrupper, nämligen som sena endothelial progenitor celler10, endothelial kolonibildande cel…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta material bygger på arbete stöds av National Science Foundation under Grant nr CMMI-1452943 och av University of Arkansas Honors College. Vi vill också erkänna den Arkansas navelsträngsblod Bank för att förse oss med sladd blod enheter.
Materials
| A) For isolation and culturing | |||
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 26140079 | |
| Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Ficoll-Paque | GE Heatlhcare | 17-1440-02 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermofisher Scientific | 14170-112 | |
| Ammonium Chloride | Stem Cell Technologies | 7850 | |
| 1X Phosphate Buffer Saline | Thermofisher Scientific | 14190250 | |
| Rat Tail I Collagen | Corning | 354236 | |
| Glacial Acetic Acid | Amresco | 0714-500ML | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| HEPES buffer | Thermofisher Scientific | 15630080 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Thermofisher Scientific | 10566-016 | |
| B) Antibodies and cell lysates | |||
| CD31 | Abcam | ab28364 | 1:250 dilution for Western blotting |
| CD34 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7045 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-SMA | abcam | ab5694 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-tubulin | abcam | ab7291 | 1:2500 dilution for Western blotting |
| VEGFR2 | abcam | sc504 | 1:100 dilution for Western blotting |
| Human umbilical vein endothelial cell lysate | Santa Cruz Biotechnology | sc24709 | |
| Valve interstitial cell lysate | Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer | ||
| C) Western blotting and immunostaining | |||
| 10X Tris/Glycine/SDS buffer | Biorad | 161-0772 | Used as running buffer |
| 10X Tris/Glycine buffer | Biorad | 161-0771 | Used as transfer buffer |
| Immobilon-FL transfer membrane | Merck Millipore | IPFL0010 | This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane |
| 4X Laemmli sample buffer | Biorad | 161-0747 | |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | 161-0710 | |
| 10% Criterion TGX precast gel | Biorad | 5671033 | |
| Prolong Gold antifade | Thermofisher Scientific | P36930 | Used for mounting immunostained coverslips for long term storage |
| Methanol | VWR Analytical | BDH1135-4LP |
Riferimenti
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105 (1), 71-77 (2000).
- Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92 (2), 362-367 (1998).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Sales, V. L., et al. Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds. Circulation. 114, 193-199 (2006).
- Sales, V. L., et al. Endothelial Progenitor Cells as a Sole Source for Ex Vivo Seeding of Tissue-Engineered Heart Valves. Tissue Eng Pt A. 16 (1), 257-267 (2010).
- Liew, A., Barry, F., O’Brien, T. Endothelial progenitor cells: diagnostic and therapeutic considerations. Bioessays. 28 (3), 261-270 (2006).
- Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
- Ingram, D. A., Caplice, N. M., Yoder, M. C. Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells. Blood. 106 (5), 1525-1531 (2005).
- Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
- Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).
- Yoder, M. C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 006692 (2012).
- Siddique, A., Shantsila, E., Lip, G. Y. H., Varma, C. Endothelial progenitor cells: what use for the cardiologist. J Angiogenes Res. 2 (6), (2010).
- Camci-Unal, G., et al. Surface-modified hyaluronic acid hydrogels to capture endothelial progenitor cells. Soft Matter. 6 (20), 5120-5126 (2010).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
- Young, P. P., Vaughan, D. E., Hatzopoulos, A. K. Biologic properties of endothelial progenitor cells and their potential for cell therapy. Prog Cardiovasc Dis. 49 (6), 421-429 (2007).
- Mehta, J. L., Szwedo, J. Circulating endothelial progenitor cells, microparticles and vascular disease. J Hypertens. 28 (8), 1611-1613 (2010).
- Nevskaya, T., et al. Circulating endothelial progenitor cells in systemic sclerosis are related to impaired angiogenesis and vascular disease manifestations. Ann Rheum Dis. 66, 67-67 (2007).
- Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, 132-137 (2006).
- Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
- Vasa, M., et al. Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 103 (24), 2885-2890 (2001).
- Wu, X., et al. Tissue-engineered microvessels on three-dimensional biodegradable scaffolds using human endothelial progenitor cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 480-487 (2004).
- Boyer, M., et al. Isolation of endothelial cells and their progenitor cells from human peripheral blood. J Vasc Surg. 31 (1), 181-189 (2000).
- Huber, B., Czaja, A. M., Kluger, P. J. Influence of epidermal growth factor (EGF) and hydrocortisone on the co-culture of mature adipocytes and endothelial cells for vascularized adipose tissue engineering. Cell Biol Int. 40 (5), 569-578 (2016).
- Sturdivant, N. M., Smith, S. G., Ali, S. F., Wolchok, J. C., Balachandran, K. Acetazolamide Mitigates Astrocyte Cellular Edema Following Mild Traumatic Brain Injury. Sci Rep. 6, 33330 (2016).
- Lam, N. T., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N., Balachandran, K. Valve interstitial cell contractile strength and metabolic state are dependent on its shape. Integr Biol (Camb). 8 (10), 1079-1089 (2016).
- Tandon, I., et al. Valve interstitial cell shape modulates cell contractility independent of cell phenotype. J Biomech. 49 (14), 3289-3297 (2016).
- Cockshell, M. P., Bonder, C. S. Isolation and Culture of Human CD133+ Non-adherent Endothelial Forming Cells. Bio-Protocol. 6 (7), (2016).
