Descriviamo un metodo basato su HPLC per la determinazione dell'acido N-acetilneuraminico e dell'acido N-glicolilenraminico nel fegato e nel latte del topo.
CMAH (idrossilasi di citidina monofosfato-N-acetilneuraminico idrossilasi) è responsabile dell'ossidazione degli acidi citidina monofosfato-N-acetilneuraminico nei mammiferi. Tuttavia, l'uomo non può ossidare l'acido di citidina monofosfato-N-acetilneuraminico a acido citidico monofosfato-N-glicolico-neuraminico a causa di una delezione primaria di esone del gene CMAH . Per comprendere in modo più approfondito gli effetti e le implicazioni della mancanza di attività CMAH , il modello Cmah in topi è di grande interesse per la ricerca di base e applicata. Il metodo di analisi per determinare il fenotipo di questo modello di topo è qui descritto in dettaglio e si basa sulla rilevazione dell'acido N-acetilneuraminico e dell'acido N-glicolenuraminico nel fegato e nel latte di topi di tipo selvatico e Cmah . Gli acidi sialici endogeni vengono liberati e derivatizzati con o-fenilendiammina per generare derivati fluorogenici, che possono essere successivamente analizzati mediante HPLC. Il protocollo presentato può essereAnche applicato per l'analisi di campioni di latte e tessuti provenienti da varie altre origini e può essere utile per indagare gli effetti nutrizionali e sanitari dell'acido N-glycolylneuraminic.
L'acido N-acetilneuraminico (Neu5Ac) e l'acido N-glycolylneuraminic (Neu5Gc) sono gli acidi sialici più comuni nella maggior parte dei mammiferi 1 . Sebbene in grado di sintetizzare Neu5Ac in modo endogeno, gli esseri umani non sono in grado di produrre Neu5Gc a causa di una delezione primaria dell'esone sul gene CMAH che codifica per una CMP-Neu5Ac idrossilasi 2 , 3 . Tuttavia, i prodotti alimentari a base di animali possono essere fonti dietetiche di Neu5Gc 4 , 5 , 6 , che portano alla produzione di anticorpi anti-Neu5Gc e quindi attivano una risposta immunitaria nei confronti di Neu5Gc 7 . Si sospetta che questo effetto dietetico di Neu5Gc contribuisca all'infiammazione cronica e alle varie malattie 8 , 9 , 10 . Per comprendere in modo completo gli effetti di Neu5Gc in hUmani, un modello animale per lo studio sistematico degli effetti degli acidi sialici alimentari è molto auspicabile. Anche se i protocolli basati sulla reazione a catena polimerica (PCR) per l'analisi dei topi knock-out sono ben stabiliti e un modo pratico per la valutazione genotipica, l'analisi funzionale del fenotipo a livello metabolico richiede metodi di analisi più specifici. Il fenotipo di un modello di topo knock-out Cmah può essere valutato isolando e analizzando la composizione degli acidi sialici nei campioni di fegato o di latte. Diversi metodi per la rilevazione di acidi sialici nei tessuti animali sono stati riportati in precedenza: la reazione degli acidi sialici con resorcinolo 11 o acido tiobarbiturico 12 determina la formazione di un prodotto cromoforico e può essere semplicemente analizzato utilizzando un setup basato su platereader, ma solo il totale sialico Può essere determinato il contenuto di acido. In alternativa, l'analisi degli acidi sialici è stata descritta anche utilizzando gas cromatografia13 , spettrometria di massa MALDI-ToF 14 o metodi amperometrici 15 . Tuttavia, i metodi di analisi dell'acido sialico più comunemente applicati sono basati sul rilascio idrolitico, seguito da derivatizzazione fluorescente e successiva cromatografia liquida ad alta prestazione 16 , 17 , 18 .
Il protocollo qui presentato consente di valutare fenotipicamente i topi omotigmatici di Cmah knock-out analizzando e quantificando le quantità relative di Neu5Gc di campioni di latte e fegato. L'analisi è stata eseguita utilizzando una configurazione standard HPLC con rilevazione di fluorescenza. La fase più critica di questa procedura è la preparazione delle colonne di scambio anionico e l'esecuzione della cromatografia per l'anione; Per sistemare correttamente la resina e per raccogl…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla Fondazione della Scienza Naturale della Cina (numeri di sovvenzione 31471703, A0201300537 e 31671854 per JV e LL) e 100 piani di talenti stranieri (numero di sovvenzione JSB2014012 a JV).
Chemicals: | |||
N-acetylneuraminic acid | Sigma | A0812 | |
N-glycolylneuraminic acid | Sigma | 50644 | 1 mg aliquot should be sufficient |
o-Phenylenediamine | Sigma | 694975 | |
Sodium hydrogen sulfite | J&K Scientific Ltd | 75234 | |
Tools/Materials: | |||
3 mL SPE tubes | Supelco | Sigma 57024 | empty solid phase extraction columns |
Luer stopcock | Sigma | S7396 | to stop the flow of the SPE tube |
Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200-400 mesh |
Dounce tissue grinder | Sigma | D8938 | tight fit |
HPLC Analysis: | |||
High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
HPLC Column | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250×4.6 mm |
LCMS-grade H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
Ammonium hydroxide solution | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |