Vi beskriver en HPLC-basert metode for bestemmelse av N-acetylneuraminsyre og N-glykolylenuraminsyre i muselever og melk.
CMAH (cytidinmonofosfat-N-acetylneuraminsyrehydroksylase) er ansvarlig for oksydasjonen av cytidinmonofosfat-N-acetylneuraminsyrer i pattedyr. Imidlertid kan mennesker ikke oksidere cytidinmonofosfat-N-acetylneuraminsyre til cytidinmonofosfat-N-glykolylneuraminsyre på grunn av en primær exon-deletjon av CMAH- genet. For å forstå effektene og implikasjonene av mangel på CMAH-aktivitet mer detaljert, er en Cmah- knock-out-modell i mus av stor interesse for grunnleggende og anvendt forskning. Analysemetoden for å bestemme fenotypen til denne musemodellen er her beskrevet i detalj, og er basert på deteksjon av både N-acetylneuraminsyre og N-glykolylenuraminsyre i leveren og melk av vill-type og Cmah- knock-out-mus. Endogene sialinsyrer frigjøres og derivatiseres med o-fenylendiamin for å danne fluorogene derivater, som deretter kan analyseres ved HPLC. Den presenterte protokollen kan væreOgså søkt om analyse av melke- og vevsprøver fra forskjellige andre opprinnelser, og kan være nyttig for å undersøke nærings- og helseeffekter av N-glykolylneuraminsyre.
N-acetylneuraminsyre (Neu5Ac) og N-glykolylneuraminsyre (Neu5Gc) er de vanligste sialinsyrene i de fleste pattedyr 1 . Selv om det er i stand til å syntetisere Neu5Ac endogent, er mennesker ikke i stand til å produsere Neu5Gc på grunn av en primær ekson deletion på CMAH genet som koder for en CMP-Neu5Ac hydroksylase 2 , 3 . Imidlertid kan animalske matvarer være kostholdskilder til Neu5Gc 4 , 5 , 6 , som fører til produksjon av anti-Neu5Gc-antistoffer og dermed utløse en immunrespons mot Neu5Gc 7 . Denne diettvirkningen av Neu5Gc er mistenkt for å bidra til kronisk betennelse og ulike andre sykdommer 8 , 9 , 10 . For å forstå forståelsen av Neu5Gc i hUmans, er en dyremodell for den systematiske studien av virkningene av matbårne sialinsyrer, svært ønskelig. Selv om protokoller basert på polymerasekjedereaksjon (PCR) for analyse av knock-out-mus er veletablert og en praktisk måte for den genotypiske vurderingen, krever funksjonell analyse av fenotype på metabolsk nivå mer spesifikke analysemetoder. Fenotypen av en Cmah- knock-out-musemodell kan vurderes ved å isolere og analysere sammensetningen av sialinsyrer i lever- eller melkeprøver. Flere metoder for påvisning av sialinsyrer i animalsk vev har tidligere blitt rapportert: omsetning av sialinsyrer med resorcinol 11 eller tiobarbitursyre 12 resulterer i dannelsen av et kromoforisk produkt og kan enkelt analyseres ved hjelp av en platereaderbasert oppsett, men bare den totale sialiske Syreinnhold kan bestemmes. Alternativt ble analysen av sialinsyrer også beskrevet under anvendelse av gaskromatografi13 , MALDI-ToF massespektrometri 14 eller amperometriske metoder 15 . Imidlertid er de mest anvendte sialinsyreanalysemetoder basert på hydrolytisk frigjøring, etterfulgt av fluorescensderivatisering og etterfølgende høyytelsesvæskekromatografi 16 , 17 , 18 .
Den her presenterte protokollen tillater fenotypisk vurdering av homozygote Cmah- knock-out-mus ved å analysere og kvantifisere de relative mengder av Neu5Gc av melk og leverprøver. Analysen ble utført ved bruk av en standard HPLC-oppsett med fluorescensdeteksjon. Det mest kritiske trinn i denne prosedyren er fremstilling av anionbytterkolonnene og utførelse av anionutvekslingskromatografi; Å avgjøre harpiksen riktig og å samle de riktige vaske- og elueringsfraksjonene tar litt øvelse.
<p class="jov…The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble delvis støttet av Natural Science Foundation of China (bevilgningsnummer 31471703, A0201300537 og 31671854 til JV og LL), og 100 Foreign Talents Plan (bevilgningsnummer JSB2014012 til JV).
Chemicals: | |||
N-acetylneuraminic acid | Sigma | A0812 | |
N-glycolylneuraminic acid | Sigma | 50644 | 1 mg aliquot should be sufficient |
o-Phenylenediamine | Sigma | 694975 | |
Sodium hydrogen sulfite | J&K Scientific Ltd | 75234 | |
Tools/Materials: | |||
3 mL SPE tubes | Supelco | Sigma 57024 | empty solid phase extraction columns |
Luer stopcock | Sigma | S7396 | to stop the flow of the SPE tube |
Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200-400 mesh |
Dounce tissue grinder | Sigma | D8938 | tight fit |
HPLC Analysis: | |||
High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
HPLC Column | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250×4.6 mm |
LCMS-grade H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
Ammonium hydroxide solution | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |