Vi beskriver en HPLC-baserad metod för bestämning av N-acetylneuraminsyra och N-glykolylenuraminsyra i muslever och mjölk.
CMAH (cytidinmonofosfat-N-acetylneuraminsyrahydroxylas) är ansvarig för oxidationen av cytidinmonofosfat-N-acetylneuraminsyror i däggdjur. Emellertid kan människor inte oxidera cytidinmonofosfat-N-acetylneuraminsyra till cytidinmonofosfat-N-glykolylneuraminsyra på grund av en primär exon deletion av CMAH- genen. För att förstå effekterna och konsekvenserna av bristen på CMAH-aktivitet mer detaljerat är en Cmah- knock-out-modell hos möss av stort intresse för grundläggande och tillämpad forskning. Analysmetoden för bestämning av fenotypen hos denna musmodell beskrivs häri i detalj och baseras på detekteringen av både N-acetylneuraminsyra och N-glykolylenuraminsyra i levern och mjölken av vildtyps- och Cmah- knock-out-möss. Endogena sialinsyror frigörs och derivatiseras med o-fenylendiamin för att alstra fluorogena derivat, som därefter kan analyseras med HPLC. Det presenterade protokollet kan varaHar också ansökt om analys av mjölk- och vävnadsprover från olika andra ursprung och kan vara av nytta för att undersöka närings- och hälsoeffekterna av N-glykolylneuraminsyra.
N-acetylneuraminsyra (Neu5Ac) och N-glykolylneuraminsyra (Neu5Gc) är de vanligaste sialinsyrorna hos de flesta däggdjur 1 . Även om det är möjligt att syntetisera Neu5Ac endogent, kan människor inte producera Neu5Gc på grund av en primär exon deletion på CMAH- genen som kodar för en CMP-Neu5Ac-hydroxylas 2 , 3 . Djurbaserade livsmedel kan dock vara kosttillskott för Neu5Gc 4 , 5 , 6 , vilket leder till produktion av anti-Neu5Gc-antikroppar och därför utlösa ett immunsvar mot Neu5Gc 7 . Denna diet effekt av Neu5Gc misstänks bidra till kronisk inflammation och olika andra sjukdomar 8 , 9 , 10 . För att fullständigt förstå effekterna av Neu5Gc i hOman är en djurmodell för den systematiska undersökningen av effekterna av matburna sialinsyror mycket önskvärt. Trots att protokoll baserade på polymeraskedjereaktion (PCR) för analys av knock-out-möss är väletablerade och ett lämpligt sätt för den genotypiska bedömningen kräver den funktionella analysen av fenotyp på metabolisk nivå mer specifika analysmetoder. Fenotypen av en Cmah- knock-out-musmodell kan bedömas genom att isolera och analysera sialinsyrans sammansättning i lever- eller mjölkprover. Flera metoder för detektering av sialinsyror i djurvävnader har tidigare rapporterats: Reaktion av sialinsyror med resorcinol 11 eller tiobarbitursyra 12 resulterar i bildning av en kromoforisk produkt och kan enkelt analyseras med en plattareaderbaserad inställning men endast den totala sialiska Syrahalten kan bestämmas. Alternativt beskrives även analysen av sialinsyror med användning av gaskromatografi13 , MALDI-ToF-masspektrometri 14 eller amperometriska metoder 15 . De mest använda sialsyraanalysmetoderna är emellertid baserade på hydrolytisk frisättning följt av fluorescensderivatisering och efterföljande högprestanda vätskekromatografi 16 , 17 , 18 .
Det här presenterade protokollet tillåter den fenotypiska bedömningen av homozygote Cmah- knock-out-möss genom att analysera och kvantifiera de relativa mängderna Neu5Gc av mjölk- och leverprover. Analysen utfördes med användning av en standard HPLC-inställning med fluorescensdetektering. Det mest kritiska steget i detta förfarande är framställning av anjonbytarkolonnerna och utförande av anjonbytarkromatografi; Att bestämma hartset ordentligt och att samla rätt tvätta och eluera fraktioner tar …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes delvis av Naturvetenskapsstiftelsen i Kina (bidragsnummer 31471703, A0201300537 och 31671854 till JV och LL) och 100 Foreign Talents Plan (bidragsnummer JSB2014012 till JV).
Chemicals: | |||
N-acetylneuraminic acid | Sigma | A0812 | |
N-glycolylneuraminic acid | Sigma | 50644 | 1 mg aliquot should be sufficient |
o-Phenylenediamine | Sigma | 694975 | |
Sodium hydrogen sulfite | J&K Scientific Ltd | 75234 | |
Tools/Materials: | |||
3 mL SPE tubes | Supelco | Sigma 57024 | empty solid phase extraction columns |
Luer stopcock | Sigma | S7396 | to stop the flow of the SPE tube |
Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200-400 mesh |
Dounce tissue grinder | Sigma | D8938 | tight fit |
HPLC Analysis: | |||
High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
HPLC Column | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250×4.6 mm |
LCMS-grade H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
Ammonium hydroxide solution | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |