Azote Cavitation et Centrifugation différentielle permet de surveiller la Distribution des protéines membranaires périphériques dans des cellules cultivées
Summary
Nous présentons ici des protocoles pour l’homogénéisation sans tensioactifs des cellules mammifères cultivées basé sur la cavitation de l’azote et la séparation ultérieure des protéines cytosoliques et membranaires par ultracentrifugation. Cette méthode est idéale pour la surveillance de la répartition des protéines membranaires périphériques entre soluble et fractions de membrane.
Abstract
Les cellules cultivées sont utiles pour étudier la distribution subcellulaire des protéines, y compris les protéines membranaires périphériques. Codé génétiquement fluorescent étiquetés protéines ont révolutionné l’étude de la distribution des protéines subcellulaire. Toutefois, il est difficile de quantifier la distribution avec la microscopie fluorescente, surtout lorsque les protéines sont partiellement cytosoliques. En outre, il est souvent important d’étudier les protéines endogènes. Biochemical tests tels que l’immuno-Blot reste l’étalon-or pour la quantification de la distribution des protéines après fractionnement subcellulaire. Bien qu’il existe des kits commerciaux visant à isoler cytosolique ou certaines fractions de la membrane, la plupart de ces kits est basée sur l’extraction avec des détergents, qui peut ne pas convenir pour l’étude des protéines membranaires périphériques qui sont facilement extraits des membranes. Nous présentons ici un protocole sans tensioactifs pour l’homogénéisation cellulaire par la cavitation de l’azote et la séparation ultérieure des protéines cytosoliques et membranaires par ultracentrifugation. Nous confirmer les fractions de granulés et de séparation des organites subcellulaires dans soluble à travers différents types de cellules et comparer l’extraction de la protéine parmi plusieurs méthodes d’homogénéisation mécanique non détergent à base commune. Parmi les nombreux avantages d’azote cavitation est l’efficacité supérieure d’une perturbation cellulaire avec un minimum de dommages physique et chimique aux organelles délicats. Combiné avec l’ultracentrifugation, cavitation d’azote est une excellente façon d’examiner le passage des protéines membranaires périphériques entre cytosolique et fractions de membrane.
Introduction
Les protéines cellulaires peuvent être divisés en deux classes : celles qui sont associées aux membranes et ceux qui ne le sont pas. Non-membrane protéines associées sont trouvent dans le cytosol, le nucléoplasme et le lumina des organites tels que le réticulum endoplasmique (re). Il y a deux classes de protéines associées aux membranes, intégrante et périphériques. Protéines intégrales de membrane sont également connu sous le nom de protéines transmembranaires parce qu’un ou plusieurs segments de la chaîne polypeptidique s’étend sur la membrane, généralement dans une hélice α composée d’acides aminés hydrophobes. Des protéines transmembranaires sont protéines insérées dans les membranes dans le cadre de leur biosynthèse et restent donc configurés jusqu’à ce qu’ils sont catabolisés. Les protéines membranaires périphériques sont secondairement poussés à membranes, généralement par suite de modification post-traductionnelle avec des molécules hydrophobes tels que les lipides. Contrairement aux protéines intégrales de membrane, la liaison des protéines membranaires périphériques avec les membranes cellulaires est réversible et peut être réglée. Nombreuses fonction de protéines membranaires périphériques dans les voies de signalisation et liaison réglementé avec membranes est un mécanisme pour activer ou inhiber une voie. Un exemple d’une molécule de signalisation qui est une protéine de membrane périphérique est la petite GTPase, RAS. Après une série de modifications post-traductionnelles qui incluent la modification avec un lipide farnésyl, mis à jour le C-terminal d’une protéine RAS mature insère dans le feuillet cytoplasmique de la membrane cellulaire. Plus précisément, la membrane plasmique est où le RAS engage son effecteur RAF1. Pour empêcher l’activation constitutive de voie de protéine mitogène-kinase (MAPK), plusieurs niveaux de contrôle de RAS sont en place. Sans compter que RAS rendu inactif par hydrolyse de GTP en PIB, RAS active aussi peut être libéré de la membrane plasmique par des modifications ou des interactions avec les facteurs pour inhiber la signalisation de solubilisation. Bien que fluorescent imagerie live offre aux biologistes cellulaires l’occasion d’observer la localisation subcellulaire des fluorescents membranaires périphériques marqués protéine protéines1, il demeure un besoin essentiel d’évaluer l’association de la membrane de protéines endogènes semi quantitativement avec des approches biochimiques simples.
Une évaluation appropriée biochimique des protéines cloisonnement entre la membrane et fractions solubles est critique dépend de deux facteurs : homogénéisation cellulaire et une séparation efficace de membrane et fractions solubles. Bien que certains protocoles, y compris les kits commercialisés plus largement utilisés, dépendent d’homogénéisation de la cellule de base de détergent, ces méthodes peuvent obscurcir l’analyse par l’extraction des protéines membranaires dans la phase soluble2. En conséquence, non détergente méthodes basés, mécaniques d’une perturbation cellulaire fournissent les résultats plus propres. Il existe plusieurs méthodes de rupture mécanique des cellules en culture ou récolte du sang ou d’organes. Il s’agit de Dounce homogénéisation, perturbation de la fine aiguille, roulement à billes homogénéisation, sonication et cavitation de l’azote. Ici, nous évaluons la cavitation d’azote et de le comparer à d’autres méthodes. Cavitation azote s’appuie sur l’azote qui est dissous dans le cytoplasme des cellules sous haute pression. Après équilibration, la suspension cellulaire est brusquement exposée à la pression atmosphérique tels que les bulles d’azote sont forment dans le cytoplasme qui déchirer la cellule en raison de leur effervescence. Si la pression est suffisamment élevée, effervescence d’azote peut perturber le noyau3 et membrane liée organites comme les lysosomes4. Toutefois, si la pression est maintenue suffisamment faible, la décompression perturbera la membrane plasmique et ER mais pas d’autres organites, déversant ainsi fois cytosol et les organites cytoplasmiques intacts dans l’homogénat désigné le cavitate5. Pour cette raison, la cavitation de l’azote est la méthode de choix pour isoler les organites comme les mitochondries et les lysosomes.
Toutefois, il est également un excellent moyen de préparer un homogénat qui peut être facilement séparé en fractions solubles et de membrane. L’appareil à pression (désormais appelé « the bomb ») utilisé au cours de la cavitation se compose d’un boîtier en acier inoxydable épais qui résiste à une pression élevée, avec une entrée pour la livraison du gaz d’azote d’un réservoir et un orifice de sortie d’une soupape de décharge réglable.
La cavitation d’azote a été utilisée pour l’homogénéisation de la cellule depuis les années 19606. En 1961, Hunter et Commerfold7 créé la cavitation de l’azote comme une option viable pour la rupture de tissus de mammifères. Depuis lors, les chercheurs ont adapté la technique à différentes cellules et tissus avec succès et cavitation de l’azote est devenu un aliment de base dans de multiples applications, y compris la membrane préparation8,9, les noyaux et les organites préparation10,11et extraction biochimique labile. Actuellement, biologistes cellulaires utilisent plus souvent les autres méthodes d’homogénéisation de la cellule parce que les avantages de l’homogénéisation de l’azote n’ont pas été largement annoncés, bombes d’azote sont chers et il y a un malentendu qui est un nombre relativement élevé de cellules Obligatoire. Protocoles de cavitation d’azote atteindre homogénats acellulaires avec noyaux intacts n’ont pas été publiés, et évaluations plus publiées volumes de 20 mL de suspension cellulaire ont été utilisées. Pour adapter cette technique classique aux besoins actuels de travailler avec petits échantillons, nous présentons un protocole modifié de cavitation azote, spécialement conçue pour les cellules cultivées. Après la cavitation de l’azote, l’homogénat est séparée en soluble (S) et les fractions membranaires (P) par centrifugation différentielle, tout d’abord avec une basse-vitesse d’essorage pour enlever les noyaux et ininterrompu de cellules, puis avec un essorage à haute vitesse (> 100 000 x g) pour séparer les membranes de la fraction soluble. Nous analysons l’efficacité de la séparation avec l’immuno-Blot et comparer la cavitation azote avec d’autres techniques de rupture mécanique. Nous étudions aussi l’effet osmotique du tampon de l’homogénéisation au cours de la cavitation de l’azote.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les avantages de cavitation d’azote par rapport aux autres méthodes de perturbation mécanique sont multiples. Peut-être l’avantage le plus significatif est sa capacité d’homogénéiser doucement mais efficacement les spécimens. Les principes physiques de décompression cools échantillons au lieu de générer dommages thermiques locales comme ultrasons et frottement/cisaillage des techniques basées sur. La cavitation est également extrêmement efficace à perturber la membrane plasmique. Parce que l’azote …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par GM055279, CA116034 et CA163489.
Materials
| Cell Disruption Vessel (45 mL) | Parr Instrument | 4639 | Nitrogen cavitation Bomb |
| Dounce homogenizer (2 mL) | Kontes | 885300-0002 | Dounce pestle and tube |
| U-100 Insulin Syringe 28G½ | Becton Dickinson | 329461 | Needle |
| Atg12 antibody | Santa Cruz | 271688 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-actin antibody | Santa Cruz | 47778 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-tubulin antibody | DSHB | E7-s | Mouse antibody, use at 1:5000 dilution |
| Calnexin antibody | Santa Cruz | 23954 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Calregulin antibody | Santa Cruz | 373863 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Catalase antibody | Santa Cruz | 271803 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| CIMPR antibody | Abcam | 124767 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| EEA1 antibody | Santa Cruz | 137130 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| EGFR antibody | Santa Cruz | 373746 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F0-ATPase antibody | Santa Cruz | 514419 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F1-ATPase antibody | Santa Cruz | 55597 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Fibrillarin antibody | Santa Cruz | 374022 | Mouse antibody, use at 1:200 dilution |
| Golgin 97 antibody | Santa Cruz | 59820 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| HDAC1 antibody | Santa Cruz | 81598 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Hexokinase 1 antibody | Cell Signaling Technology | 2024S | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Lamin A/C antibody | Santa Cruz | 376248 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| LAMP1 antibody | DSHB | H4A3-c | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Na+/K+ ATPase antibody | Santa Cruz | 48345 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab7 antibody | Abcam | 137029 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab9 antibody | Thermo | MA3-067 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RCAS1 antibody | Santa Cruz | 398052 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RhoGDI antibody | Santa Cruz | 360 | Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution |
| Ribosomal protein S6 antibody | Santa Cruz | 74459 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Sec61a antibody | Santa Cruz | 12322 | Goat antibody, use at 1:1000 dilution |
| Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 349622 | Sample tube for ultracentrifugation |
| TLK-100.3 rotor | Beckman Coulter | 349481 | rotor for ultracentrifugation |
| Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 364300 | ultracentrifuge |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11697498001 | protease inhibitors |
| Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade | Corning | 353089 | large cell scraper |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-57SIX | micro stir bar |
| Ceramic-Top Magnetic Stirrer | Fisher Scientific | S504501AS | magnetic stirrer |
Riferimenti
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