नाइट्रोजन Cavitation और अवकलन केंद्रापसारक संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं में परिधीय झिल्ली प्रोटीन के वितरण की निगरानी के लिए अनुमति देता है
Summary
यहां हम डिटर्जेंट के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल homogenization स्तनधारी नाइट्रोजन cavitation और ultracentrifugation द्वारा cytosolic और झिल्ली से बंधे प्रोटीन के बाद जुदाई के आधार पर प्रसंस्कृत कोशिकाओं के मुक्त । यह विधि घुलनशील और झिल्ली भिन्न के बीच परिधीय झिल्ली प्रोटीन के विभाजन की निगरानी के लिए आदर्श है ।
Abstract
प्रसंस्कृत कोशिकाओं परिधीय झिल्ली प्रोटीन सहित प्रोटीन के उपसेलुलर वितरण का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होते हैं । आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग सेलुलर प्रोटीन वितरण के अध्ययन में क्रांति ला दिया है । हालांकि, यह फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के साथ वितरण, विशेष रूप से जब प्रोटीन आंशिक रूप से cytosolic है यों तो मुश्किल है । इसके अलावा, यह अक्सर अंतर्जात प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है । immunoblots जैसे जैव रासायनिक परख सेलुलर अंश के बाद प्रोटीन वितरण के ठहराव के लिए सोने के मानक बने रहते हैं । हालांकि वहाँ वाणिज्यिक किट है कि cytosolic या कुछ झिल्ली भिन्न अलग करने के लिए लक्ष्य कर रहे हैं, इन किट के अधिकांश डिटर्जेंट के साथ निष्कर्षण पर आधारित हैं, जो परिधीय झिल्ली प्रोटीन है कि आसानी से झिल्ली से निकाले जाते हैं का अध्ययन करने के लिए अनुपयुक्त हो सकता है. यहां हम नाइट्रोजन cavitation द्वारा सेलुलर homogenization के लिए एक डिटर्जेंट मुक्त प्रोटोकॉल वर्तमान और ultracentrifugation द्वारा cytosolic और झिल्ली से बंधे प्रोटीन के बाद जुदाई । हम विभिंन प्रकार के सेल में घुलनशील और गोली भागों में सेलुलर organelles के जुदाई की पुष्टि करें, और कई आम गैर डिटर्जेंट-आधारित यांत्रिक homogenization तरीकों के बीच प्रोटीन निष्कर्षण की तुलना करें । नाइट्रोजन cavitation के कई फायदों के बीच नाजुक organelles के लिए न्यूनतम शारीरिक और रासायनिक क्षति के साथ सेलुलर व्यवधान की बेहतर दक्षता है । ultracentrifugation के साथ संयुक्त, नाइट्रोजन cavitation cytosolic और झिल्ली भिन्न के बीच परिधीय झिल्ली प्रोटीन के बदलाव की जाँच करने के लिए एक उत्कृष्ट विधि है ।
Introduction
सेलुलर प्रोटीन दो वर्गों में विभाजित किया जा सकता है: उन है कि झिल्ली और उन है कि नहीं कर रहे है के साथ जुड़े रहे हैं । गैर-झिल्ली संबद्ध प्रोटीन organelles के cytosol, nucleoplasm और lumina जैसे endoplasmic जालिका (ईआर) में पाए जाते हैं. वहां झिल्ली के दो वर्गों-जुड़े प्रोटीन, अभिंन और परिधीय हैं । अभिंन झिल्ली प्रोटीन भी transmembrane प्रोटीन के रूप में जाना जाता है क्योंकि पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के एक या एक से अधिक क्षेत्रों झिल्ली spans, आमतौर पर एक α के रूप में hydrophobic अमीनो एसिड से बना कुंडलित । Transmembrane प्रोटीन सह-अनुवाद उनके गैर संश्लेषण के दौरान झिल्ली में डाला जाता है और जब तक वे catabolized रहे हैं तो कॉन्फ़िगर किया गया है । परिधीय झिल्ली प्रोटीन secondarily झिल्ली के लिए प्रेरित कर रहे हैं, आमतौर पर इस तरह लिपिड के रूप में hydrophobic अणुओं के साथ पोस्ट-शोधों संशोधन का एक परिणाम के रूप में । अभिंन झिल्ली प्रोटीन के विपरीत, सेलुलर झिल्ली के साथ परिधीय झिल्ली प्रोटीन के संघ प्रतिवर्ती है और विनियमित किया जा सकता है । संकेत रास्ते में कई परिधीय झिल्ली प्रोटीन समारोह, और झिल्ली के साथ विनियमित संघ को सक्रिय करने या एक मार्ग बाधा के लिए एक तंत्र है । एक संकेत अणु कि एक परिधीय झिल्ली प्रोटीन है की एक उदाहरण के छोटे GTPase, रास है । एक farnesyl लिपिड के साथ संशोधन शामिल है कि पोस्ट-शोधों संशोधनों की एक श्रृंखला के बाद, सेलुलर झिल्ली के cytoplasmic पुस्तिका में एक परिपक्व रास प्रोटीन आवेषण के संशोधित सी-टर्मिनस. विशेष रूप से, प्लाज्मा झिल्ली जहां रास अपनी बहाव प्रभाव RAF1 संलग्न है । mitogen-सक्रिय प्रोटीन कळेनासे (MAPK) मार्ग के गठन सक्रियण को रोकने के लिए, रास के नियंत्रण के कई स्तरों जगह में हैं । सकल घरेलू उत्पाद में hydrolyzing GTP द्वारा रास निष्क्रिय प्रतिपादन के अलावा, सक्रिय रास भी संशोधनों या solubilizing कारकों के साथ बातचीत द्वारा प्लाज्मा झिल्ली से जारी किया जा सकता है संकेतन बाधित । हालांकि फ्लोरोसेंट लाइव इमेजिंग मुलाजिम सेल जीव को फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उपसेलुलर स्थानीयकरण का पालन करने का अवसर-परिधीय झिल्ली प्रोटीन1टैग, वहां एक महत्वपूर्ण के लिए झिल्ली एसोसिएशन के मूल्यांकन की जरूरत बनी हुई है अंतर्जात प्रोटीन अर्द्ध मात्रात्मक सरल जैव रासायनिक दृष्टिकोण के साथ ।
झिल्ली और घुलनशील अंशों के बीच प्रोटीन के विभाजन का उचित जैव रासायनिक मूल्यांकन गंभीर रूप से दो कारकों पर निर्भर है: सेलुलर homogenization और झिल्ली और घुलनशील अंशों का कुशल पृथक्करण । हालांकि सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया वाणिज्यिक किट सहित कुछ प्रोटोकॉल, डिटर्जेंट आधारित कोशिका homogenization पर निर्भर करता है, इन तरीकों घुलनशील चरण2में झिल्ली प्रोटीन निकालने के द्वारा विश्लेषण गड़बड़ाने कर सकते हैं । तदनुसार, गैर-डिटर्जेंट आधारित, कोशिका व्यवधान के यांत्रिक तरीके क्लीनर परिणाम प्रदान करते हैं । वहां कोशिकाओं के यांत्रिक विघटन के कई तरीके है या रक्त या अंगों से काटा संस्कृति में उगाया । ये Dounce homogenization, ठीक सुई व्यवधान, गेंद असर homogenization, sonication और नाइट्रोजन cavitation शामिल हैं । यहां हम नाइट्रोजन cavitation का मूल्यांकन और अंय तरीकों से तुलना करें । नाइट्रोजन cavitation उच्च दबाव के तहत कोशिकाओं के कोशिका में भंग कर रहा है कि नाइट्रोजन पर निर्भर करता है । equilibration के बाद, सेल निलंबन अचानक वायुमंडलीय दबाव ऐसी है कि नाइट्रोजन बुलबुले कोशिका कि आंसू अपने बुदबुदाहट का एक परिणाम के रूप में सेल खोलने में गठन कर रहे है के संपर्क में है । यदि दबाव पर्याप्त उच्च है, नाइट्रोजन बुदबुदाहट नाभिक को बाधित कर सकते हैं3 और झिल्ली बंधे organelles की तरह lysosomes4. हालांकि, अगर दबाव काफी कम रखा है, संपीड़न प्लाज्मा झिल्ली और एर लेकिन नहीं अंय organelles बाधित है, जिससे दोनों cytosol और बरकरार cytoplasmic organelles homogenate कि cavitate5नामित है में फैल जाएगा । इस कारण से, नाइट्रोजन cavitation lysosomes और mitochondria की तरह organelles को अलग करने के लिए पसंद की विधि है ।
हालांकि, यह भी एक homogenate है कि आसानी से झिल्ली और घुलनशील भागों में अलग किया जा सकता है तैयार करने का एक शानदार तरीका है । दबाव पोत (बाद में कहा जाता है “बम”) cavitation के दौरान इस्तेमाल एक मोटी स्टेनलेस स्टील आवरण है कि उच्च दबाव झेलने के होते हैं, एक टैंक से नाइट्रोजन गैस के वितरण के लिए एक प्रवेश और एक समायोज्य निर्वहन वाल्व के साथ एक दुकान बंदरगाह के साथ ।
नाइट्रोजन cavitation सेल homogenization के लिए 1960 के दशक के बाद से इस्तेमाल किया गया है6। १९६१ में, हंटर और Commerfold7 स्तनधारी ऊतक व्यवधान के लिए एक व्यवहार्य विकल्प के रूप में नाइट्रोजन cavitation की स्थापना की । तब से, शोधकर्ताओं ने तकनीक को सफलता के साथ विभिंन कोशिकाओं और ऊतकों को अनुकूलित किया है, और नाइट्रोजन cavitation झिल्ली की तैयारी सहित कई अनुप्रयोगों में एक प्रधान बन गया है8,9, नाभिक और organelle तैयारी10,11, और labile जैव रासायनिक निष्कर्षण । वर्तमान में, सेल जीव अधिक बार सेल homogenization के अंय तरीकों को रोजगार क्योंकि नाइट्रोजन homogenization के लाभों को व्यापक रूप से विज्ञापित नहीं किया गया है, नाइट्रोजन बम महंगे है और वहां एक गलत धारणा है कि कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत बड़ी संख्या है आवश्यक. बरकरार नाभिक के साथ सेल मुक्त homogenates प्राप्त करने के लिए नाइट्रोजन cavitation के लिए प्रोटोकॉल प्रकाशित नहीं किया गया है, और सेल निलंबन के 20 मिलीलीटर के सबसे प्रकाशित मूल्यांकन संस्करणों में इस्तेमाल किया गया । छोटे पैमाने के नमूनों के साथ काम करने की वर्तमान आवश्यकताओं के अनुरूप करने के लिए इस क्लासिक तकनीक को अनुकूलित करने के लिए, हम विशेष रूप से संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं के लिए बनाया गया नाइट्रोजन cavitation का एक संशोधित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । नाइट्रोजन cavitation के बाद, homogenate में घुलनशील (S) और झिल्ली (P) भिन्न है अंतर केंद्रापसारक द्वारा, नाभिक और अटूट कोशिकाओं को दूर करने के लिए एक कम गति स्पिन के साथ पहले, और फिर एक उच्च गति स्पिन के साथ (& #62; १००,००० x g) अलग करने के लिए घुलनशील अंश से झिल्ली. हम immunoblots के साथ जुदाई की दक्षता का विश्लेषण और अन्य यांत्रिक व्यवधान तकनीक के साथ नाइट्रोजन cavitation की तुलना करें । हम भी नाइट्रोजन cavitation के दौरान homogenization बफर के परासरणी प्रभाव की जांच ।
Protocol
1. बफर और उपकरण तैयारियां चिल ४५ एमएल सेल व्यवधान बम, 15 मिलीलीटर ट्यूबों, और ultracentrifugation ट्यूबों पर 4 & #176; ग. तैयार और चिल homogenization बफर के 25 मिलीलीटर प्रति 2 x 10 7 कोशिकाओं पर 4 & #176; C. बस उपयोग करने से पहले एक ?…
Representative Results
Discussion
यांत्रिक व्यवधान के अंय तरीकों पर नाइट्रोजन cavitation के लाभ कई गुना हैं । शायद सबसे महत्वपूर्ण लाभ अपने धीरे अभी तक कुशलतापूर्वक homogenize नमूनों की क्षमता है । संपीड़न के भौतिक सिद्धांतों के बजाय अल्ट्रासोनिक…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को GM055279, CA116034 और CA163489 ने वित्तपोषित किया था.
Materials
| Cell Disruption Vessel (45 mL) | Parr Instrument | 4639 | Nitrogen cavitation Bomb |
| Dounce homogenizer (2 mL) | Kontes | 885300-0002 | Dounce pestle and tube |
| U-100 Insulin Syringe 28G½ | Becton Dickinson | 329461 | Needle |
| Atg12 antibody | Santa Cruz | 271688 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-actin antibody | Santa Cruz | 47778 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-tubulin antibody | DSHB | E7-s | Mouse antibody, use at 1:5000 dilution |
| Calnexin antibody | Santa Cruz | 23954 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Calregulin antibody | Santa Cruz | 373863 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Catalase antibody | Santa Cruz | 271803 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| CIMPR antibody | Abcam | 124767 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| EEA1 antibody | Santa Cruz | 137130 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| EGFR antibody | Santa Cruz | 373746 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F0-ATPase antibody | Santa Cruz | 514419 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F1-ATPase antibody | Santa Cruz | 55597 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Fibrillarin antibody | Santa Cruz | 374022 | Mouse antibody, use at 1:200 dilution |
| Golgin 97 antibody | Santa Cruz | 59820 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| HDAC1 antibody | Santa Cruz | 81598 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Hexokinase 1 antibody | Cell Signaling Technology | 2024S | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Lamin A/C antibody | Santa Cruz | 376248 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| LAMP1 antibody | DSHB | H4A3-c | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Na+/K+ ATPase antibody | Santa Cruz | 48345 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab7 antibody | Abcam | 137029 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab9 antibody | Thermo | MA3-067 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RCAS1 antibody | Santa Cruz | 398052 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RhoGDI antibody | Santa Cruz | 360 | Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution |
| Ribosomal protein S6 antibody | Santa Cruz | 74459 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Sec61a antibody | Santa Cruz | 12322 | Goat antibody, use at 1:1000 dilution |
| Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 349622 | Sample tube for ultracentrifugation |
| TLK-100.3 rotor | Beckman Coulter | 349481 | rotor for ultracentrifugation |
| Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 364300 | ultracentrifuge |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11697498001 | protease inhibitors |
| Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade | Corning | 353089 | large cell scraper |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-57SIX | micro stir bar |
| Ceramic-Top Magnetic Stirrer | Fisher Scientific | S504501AS | magnetic stirrer |
Riferimenti
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