Cavitação de nitrogênio e centrifugação diferencial permite o monitoramento da distribuição de proteínas de membrana periférica em culturas de células
Summary
Aqui apresentamos os protocolos para homogeneização de detergente livre de células de mamíferos cultivadas com base no azoto cavitação e posterior separação de proteínas do citosol e membrana-limite por ultracentrifugação. Este método é ideal para monitorar o particionamento de proteínas de membrana periférica entre solúvel e fracções de membrana.
Abstract
As células cultivadas são úteis para estudar a distribuição subcelular de proteínas, incluindo proteínas periféricas da membrana. Geneticamente codificado fluorescente etiquetadas proteínas revolucionou o estudo da distribuição Subcellular da proteína. No entanto, é difícil quantificar a distribuição com microscopia fluorescente, especialmente quando as proteínas são parcialmente citosólica. Além disso, muitas vezes é importante estudar proteínas endógenas. Bioquímicos ensaios tais como immunoblots permanecem o padrão ouro para quantificação da distribuição de proteínas após fracionamento subcelular. Embora existam jogos comerciais que visam isolar citosólica ou certas fracções de membrana, a maioria destes jogos é baseada na extração com detergentes, que podem ser inadequados para o estudo de proteínas de membrana periférica que facilmente são extraídas de membranas. Aqui nós apresentamos um protocolo livre de detergente para celular homogeneização por cavitação de nitrogênio e posterior separação de proteínas do citosol e membrana-limite por ultracentrifugação. Podemos confirmar a separação de organelas subcelulares em solúvel e pelota frações através de diferentes tipos de células e comparar a extração de proteínas entre vários métodos de homogeneização mecânica não baseados em detergente comum. Entre várias vantagens de azoto cavitação é a eficiência superior de ruptura celular com o mínimo de danos físico e químico para organelas delicados. Combinado com ultracentrifugação, cavitação de nitrogênio é um excelente método para examinar a mudança das proteínas de membrana periférica entre citosol e membrana fracções.
Introduction
Proteínas celulares podem ser divididas em duas classes: aqueles que estão associados com membranas e aqueles que não são. Non-membrana proteínas associadas são encontradas no citosol, nucleoplasma e lumina de organelas como o retículo endoplasmático (ER). Existem duas classes de proteínas de membrana-associado, integrais e periféricas. Proteínas integrais da membrana são também conhecidas como proteínas transmembrana porque um ou mais segmentos da corrente do polypeptide atravessa a membrana, normalmente como um composto de aminoácidos hidrofóbicos α-hélice. Proteínas transmembrana co-translationally são inseridas em membranas no decorrer de sua biossíntese e permanecem assim configuradas até que eles são catabolizados. Proteínas periféricas da membrana secundariamente são levadas a membranas, geralmente como consequência de modificação pós-traducional com moléculas hidrofóbicas, tais como lipídios. Em contraste com as proteínas integrais de membrana, a associação de proteínas de membrana periférica com membranas celulares é reversível e pode ser regulada. Função de proteínas de membrana periférica muitas em vias de sinalização e regulamentada associação com membranas é um mecanismo para ativar ou inibir um caminho. Um exemplo de uma molécula de sinalização que é uma proteína de membrana periférica é a pequena GTPase, RAS. Após uma série de modificações borne-translational que incluem modificação com um lipídico farnesil, modificado C-terminal de uma proteína RAS maduro insere-se no folheto da citoplasmático da membrana celular. Especificamente, a membrana plasmática é onde o RAS envolve sua jusante efetoras RAF1. Para evitar a ativação constitutiva do mitogen-ativado proteína quinase (MAPK) via, vários níveis de controle de RAS estão no lugar. Além de renderização RAS inativo por hidrólise de GTP em GDP, RAS ativo também podem ser liberados da membrana plasmática, modificações ou interações com fatores para inibir a sinalização de solubilizing. Embora fluorescente imagens ao vivo proporciona biólogos de célula a oportunidade de observar a Localização subcellular de proteínas da membrana periférica com tag proteína fluorescente1, ainda há uma necessidade crítica para avaliar a associação de membrana de proteínas endógenas semi-quantitativamente com simples abordagens bioquímicas.
A adequada avaliação bioquímica de proteína particionamento entre a membrana e frações solúveis é criticamente dependente de dois fatores: homogeneização celular e separação eficiente de membrana e frações solúveis. Embora alguns protocolos, incluindo os kits comercializados mais amplamente utilizados, dependem de homogeneização de detergente à base da célula, estes métodos podem ofuscar análise pela extração de proteínas de membrana para a fase solúvel2. Por conseguinte, detergente não-mecânicos, baseado em métodos de rompimento da pilha fornecem resultados mais limpos. Existem vários métodos de ruptura mecânica das células cultivadas em cultura ou colheita de sangue ou órgãos. Estes incluem homogenizacao homogeneização, rompimento de agulha fina, homogeneização do rolamento de esferas, sonication e cavitação de nitrogênio. Aqui podemos avaliar cavitação de nitrogênio e compará-lo com outros métodos. Cavitação de nitrogênio depende de nitrogênio que é dissolvido no citoplasma das células sob alta pressão. Depois de equilibração, a suspensão de eritrócitos é abruptamente exposta à pressão atmosférica tal que formam-se bolhas de nitrogênio no citoplasma que rasgue a célula como consequência de sua efervescência. Se a pressão for suficientemente elevada, efervescência de nitrogênio pode interromper o núcleo3 e membrana limite organelas como lisossomos4. No entanto, se a pressão é mantida baixa o suficiente, a descompressão vai interromper a membrana plasmática e ER mas não outras organelas, desse modo, derramando tanto citoplasma e organelas citoplasmáticas intactas para o homogenate designado o cavitate5. Por esta razão, cavitação de nitrogênio é o método de escolha para isolar organelas como lisossomos e mitocôndrias.
No entanto, também é uma excelente maneira de preparar um homogenate que pode ser facilmente separada em membrana e frações solúveis. O vaso de pressão (doravante denominado “a bomba”) usado durante a cavitação consiste de um invólucro de aço inoxidável espesso que resiste a alta pressão, com uma entrada para a entrega do gás nitrogênio de um tanque e uma porta de saída com uma válvula de descarga ajustável.
Cavitação de nitrogênio tem sido usada para homogeneização de célula desde a década de 1960,6. Em 1961, Hunter e Commerfold7 estabeleceu cavitação de nitrogênio como uma opção viável para o rompimento de tecidos de mamíferos. Desde então, pesquisadores adaptaram-se a técnica de várias células e tecidos com sucesso, e cavitação de nitrogênio tornou-se um grampo em vários aplicativos, incluindo preparação de membrana8,9, núcleos e organela preparação de10,11e extração bioquímica lábil. Atualmente, biólogos da célula mais frequentemente empregam outros métodos de homogeneização de celular porque os benefícios de homogeneização de nitrogênio não têm sido amplamente divulgados, bombas de nitrogênio são caras e há um equívoco que é um número relativamente grande de células Necessário. Protocolos para cavitação de nitrogênio alcançar homogenates livre de células com núcleos intactos não tenham sido publicados, e em avaliações publicadas mais volumes de 20 mL da suspensão de células foram usados. Para adaptar esta técnica clássica para atender às necessidades atuais de trabalhar com amostras em pequena escala, apresentamos um protocolo modificado de cavitação de nitrogênio projetado especificamente para pilhas cultivadas. Após a cavitação de nitrogênio, o homogeneizado é separado em solúveis (S) e frações de membrana (P) por centrifugação diferencial, primeiro com uma rotação de baixa velocidade para remover núcleos e células ininterrupta e depois com uma rotação de alta velocidade (> g x 100.000) para separar membranas da fracção solúvel. Podemos analisar a eficiência da separação com immunoblots e comparar a cavitação de nitrogênio com outras técnicas de ruptura mecânica. Também investigamos o efeito osmótico de tampão de homogeneização durante a cavitação de nitrogênio.
Protocol
Representative Results
Discussion
As vantagens da cavitação de nitrogênio sobre outros métodos de ruptura mecânica são múltiplas. Talvez o benefício mais significativo é a sua capacidade para suavemente ainda eficientemente homogeneizar as amostras. Os princípios físicos de descompressão esfria amostras em vez de gerar danos de aquecimento local como ultra-som e fricção/corte com base em técnicas. A cavitação é também extremamente eficiente em rompendo a membrana plasmática. Porque o nitrogênio bolhas são geradas dentro de cada cél…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo GM055279, CA116034 e CA163489.
Materials
| Cell Disruption Vessel (45 mL) | Parr Instrument | 4639 | Nitrogen cavitation Bomb |
| Dounce homogenizer (2 mL) | Kontes | 885300-0002 | Dounce pestle and tube |
| U-100 Insulin Syringe 28G½ | Becton Dickinson | 329461 | Needle |
| Atg12 antibody | Santa Cruz | 271688 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-actin antibody | Santa Cruz | 47778 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-tubulin antibody | DSHB | E7-s | Mouse antibody, use at 1:5000 dilution |
| Calnexin antibody | Santa Cruz | 23954 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Calregulin antibody | Santa Cruz | 373863 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Catalase antibody | Santa Cruz | 271803 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| CIMPR antibody | Abcam | 124767 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| EEA1 antibody | Santa Cruz | 137130 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| EGFR antibody | Santa Cruz | 373746 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F0-ATPase antibody | Santa Cruz | 514419 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F1-ATPase antibody | Santa Cruz | 55597 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Fibrillarin antibody | Santa Cruz | 374022 | Mouse antibody, use at 1:200 dilution |
| Golgin 97 antibody | Santa Cruz | 59820 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| HDAC1 antibody | Santa Cruz | 81598 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Hexokinase 1 antibody | Cell Signaling Technology | 2024S | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Lamin A/C antibody | Santa Cruz | 376248 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| LAMP1 antibody | DSHB | H4A3-c | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Na+/K+ ATPase antibody | Santa Cruz | 48345 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab7 antibody | Abcam | 137029 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab9 antibody | Thermo | MA3-067 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RCAS1 antibody | Santa Cruz | 398052 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RhoGDI antibody | Santa Cruz | 360 | Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution |
| Ribosomal protein S6 antibody | Santa Cruz | 74459 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Sec61a antibody | Santa Cruz | 12322 | Goat antibody, use at 1:1000 dilution |
| Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 349622 | Sample tube for ultracentrifugation |
| TLK-100.3 rotor | Beckman Coulter | 349481 | rotor for ultracentrifugation |
| Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 364300 | ultracentrifuge |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11697498001 | protease inhibitors |
| Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade | Corning | 353089 | large cell scraper |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-57SIX | micro stir bar |
| Ceramic-Top Magnetic Stirrer | Fisher Scientific | S504501AS | magnetic stirrer |
Riferimenti
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