Кавитация азота и дифференциального центрифугирования позволяет для контроля за распределением периферийных мембранных белков в культивируемых клеток
Summary
Здесь мы представляем протоколы для моющих средств свободный гомогенизации культивируемых клеток млекопитающих, азота кавитации и последующее разделение белков цитозольной и мембраны привязкой на основе ultracentrifugation. Этот метод идеально подходит для мониторинга секционирование периферийных мембранных белков между растворимых и мембраны фракции.
Abstract
Культивируемых клеток являются полезными для изучения субцеллюлярные распределение белков, включая периферийные мембранных белков. Генетически закодированный дневно тегами белки революционизировал изучение распределения внутриклеточных белков. Однако трудно дать количественную оценку распределения с помощью флуоресцентной микроскопии, особенно когда белки являются частично цитозольной. Кроме того важно изучить эндогенного белков. Биохимическая assays, такие, как иммуноблотов остаются золотой стандарт для количественной оценки распределения белка после субцеллюлярные фракционирования. Хотя есть коммерческие наборы, которые стремятся изолировать цитозольной или определенных фракций мембраны, большинство этих комплектов основаны на добычу с моющих средств, которые могут быть неподходящими для изучения периферических мембранных белков, которые легко извлекаются из мембраны. Здесь мы представляем бесплатный стиральный порошок протокол для сотовых гомогенизации азота кавитации и последующее разделение белков цитозольной и мембраны прыгните на ultracentrifugation. Мы подтверждаем разделение внутриклеточных органелл в растворимые и Пелле фракции через различных типов клеток и сравните экстракции белка среди нескольких общих методов на основе моющих средств механической гомогенизации. Среди нескольких преимуществ азота кавитации является превосходной эффективности клеточных нарушений с минимальными физические и химические повреждения тонкий органеллы. В сочетании с ultracentrifugation, кавитация азота является отличным способом для изучения сдвиг периферийных мембранных белков между цитозольной и мембраны фракции.
Introduction
Клетчатые протеины можно разделить на два класса: те, которые связаны с мембраны и те, которые не являются. Non мембранных белков и связанные находятся в цитозоле, нуклеоплазмы и lumina органеллы например эндоплазменный ретикулум (ER). Существует два класса связанный мембранами белков, неотъемлемой и периферийных устройств. Неотъемлемой мембранных белков, также известный как трансмембранные белки, потому что один или несколько сегментов цепи полипептида охватывает мембраны, как правило в α-спирали состоит из гидрофобных аминокислот. Трансмембранные белки co-translationally вставляются в мембраны в ходе их биосинтез и остаются так настроен до тех пор, пока они являются голодании. Периферические мембранных белков вынуждены вторично мембраны, обычно вследствие столб-поступательные изменения с гидрофобные молекулы, такие как липиды. В отличие от составной мембранных белков Ассоциация периферийных мембранных белков с клеточных мембран является обратимым и может регулироваться. Многие функции белков периферийных мембраны в сигнальных путей и регулируемых ассоциацией с мембран является одним из механизмов для активации или препятствующих путь. Одним из примеров сигнальной молекулы, что периферической мембранный белок является небольшой ГТФазы, ран. После серии столб-поступательные изменения, которые включают модификации с Фарнезилпирофосфат липидов изменение C-конечная зрелой белок RAS вставляет в цитоплазматических листовка клеточной мембраны. В частности плазматической мембраны является, где ран занимается ее течению эффекторных RAF1. Чтобы предотвратить учредительный активации Митоген активированный протеин киназы (MAPK) пути, несколько уровней управления РАН находятся на месте. Кроме предоставляемых РАН неактивных гидроизолирующей GTP в ВВП, активные РАН также могут быть освобождены от плазматической мембраны путем изменения или взаимодействия с растворяющие факторы для подавления сигналов. Хотя флуоресцентные живых изображений дает клеточных биологов возможность наблюдать за субцеллюлярные локализации флуоресцентный протеин тегами периферийных мембранные белки1, остается крайне необходимо оценить мембраны ассоциации эндогенные белки полу количественно с простой биохимических подходов.
Надлежащей оценки биохимических белка перегородки между мембраной и растворимых фракций зависит от двух факторов: сотовой гомогенизации и эффективное разделение мембраны и растворимых фракций. Хотя некоторые протоколы, включая наиболее широко используемых коммерциализированной наборы, зависят от гомогенизации ячейки на основе моющих средств, эти методы могут запутывать анализа путем извлечения мембранных белков в растворимые фаза2. Соответственно без моющих средств на основе, механические методы разрушения клеток предоставляют результаты уборщика. Существует несколько методов механического разрушения клеток выросли в культуре или заготавливаемым из крови или органов. К ним относятся Dounce гомогенизации, нарушения тонкой иглой, -подшипник гомогенизации, sonication и азота кавитации. Здесь мы оцениваем азота кавитации и сравнить его с другими методами. Кавитация азота зависит от азота, растворенных в цитоплазме клеток под высоким давлением. После уравновешивания суспензию клеток резко подвергается воздействию атмосферного давления таким образом, что в цитоплазме, разорвать клеток вследствие их вскипания образуются пузырьки азота. Если давление является достаточно высоким, пузырьков азота может нарушить ядра3 и мембраной связаны органеллы как лизосомы4. Однако если давление сохраняется достаточно низкий, декомпрессия нарушит плазматической мембраны и ER, но не другие органеллы, тем самым разлив цитозоле и нетронутыми цитоплазматических органелл в огневки, который обозначается cavitate5. По этой причине кавитации азота является методом выбора для изоляции как лизосом и митохондрии органеллы.
Однако это также отличный способ подготовки огневки, который может быть легко разделена на мембраны и растворимых фракций. Сосуд под давлением (отныне называется «бомба») используется в процессе кавитации состоит из корпуса из нержавеющей стали толщиной, выдерживает высокое давление, с входом для доставки газ азот из танка и напорный канал с регулируемой разгрузочный клапан.
Кавитация азота был использован для гомогенизации клеток начиная с 1960-х6. В 1961 году Хантер и Commerfold7 создана кавитации азота как жизнеспособный вариант для млекопитающих тканей срыв. С тех пор исследователи приспособились технику для различных клеток и тканей с успехом, и азота кавитации стал штапель в нескольких приложениях, включая мембраны подготовка8,9, ядер и органелл Подготовка10,11и лабильных биохимических добычи. В настоящее время клеточных биологов чаще используют другие методы клеток гомогенизации, потому что преимущества азота гомогенизации широко не объявлена, бомбы азота являются дорогостоящими и есть заблуждение, что относительно большое количество клеток Обязательно. Протоколы для кавитации азота для достижения свободных клеток гомогенатах с нетронутыми ядра не были опубликованы, и в наиболее опубликованных оценок использовались объемы 20 мл суспензии клеток. Чтобы адаптировать этот классический метод для удовлетворения текущих требований работы с небольших образцов, мы представляем измененный Протокол азота кавитации, специально предназначенные для культивируемых клеток. После азота кавитации, огневки разделяется на водорастворимые (S) и мембранные (P) фракции, дифференциального центрифугирования, сначала с низкой скорости отжима для удаления ядра и нерушимой клетки, а затем с высокоскоростным вращением (> 100 000 x g) для разделения мембраны из растворимых фракции. Мы анализируем эффективность разделения с иммуноблотов и сравните азота кавитации с другими методами механического нарушения. Мы также расследовать осмотического эффекта гомогенизации буфера во время азота кавитации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Преимущества кавитации азота над другими методами механического разрушения многообразны. Возможно наиболее значительные выгоды является его способность мягко, но эффективно гомогенизировать образцов. Физические принципы декомпрессии охлаждает образцы вместо создания местного наг…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась GM055279, CA116034 и CA163489.
Materials
| Cell Disruption Vessel (45 mL) | Parr Instrument | 4639 | Nitrogen cavitation Bomb |
| Dounce homogenizer (2 mL) | Kontes | 885300-0002 | Dounce pestle and tube |
| U-100 Insulin Syringe 28G½ | Becton Dickinson | 329461 | Needle |
| Atg12 antibody | Santa Cruz | 271688 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-actin antibody | Santa Cruz | 47778 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-tubulin antibody | DSHB | E7-s | Mouse antibody, use at 1:5000 dilution |
| Calnexin antibody | Santa Cruz | 23954 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Calregulin antibody | Santa Cruz | 373863 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Catalase antibody | Santa Cruz | 271803 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| CIMPR antibody | Abcam | 124767 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| EEA1 antibody | Santa Cruz | 137130 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| EGFR antibody | Santa Cruz | 373746 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F0-ATPase antibody | Santa Cruz | 514419 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F1-ATPase antibody | Santa Cruz | 55597 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Fibrillarin antibody | Santa Cruz | 374022 | Mouse antibody, use at 1:200 dilution |
| Golgin 97 antibody | Santa Cruz | 59820 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| HDAC1 antibody | Santa Cruz | 81598 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Hexokinase 1 antibody | Cell Signaling Technology | 2024S | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Lamin A/C antibody | Santa Cruz | 376248 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| LAMP1 antibody | DSHB | H4A3-c | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Na+/K+ ATPase antibody | Santa Cruz | 48345 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab7 antibody | Abcam | 137029 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab9 antibody | Thermo | MA3-067 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RCAS1 antibody | Santa Cruz | 398052 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RhoGDI antibody | Santa Cruz | 360 | Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution |
| Ribosomal protein S6 antibody | Santa Cruz | 74459 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Sec61a antibody | Santa Cruz | 12322 | Goat antibody, use at 1:1000 dilution |
| Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 349622 | Sample tube for ultracentrifugation |
| TLK-100.3 rotor | Beckman Coulter | 349481 | rotor for ultracentrifugation |
| Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 364300 | ultracentrifuge |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11697498001 | protease inhibitors |
| Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade | Corning | 353089 | large cell scraper |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-57SIX | micro stir bar |
| Ceramic-Top Magnetic Stirrer | Fisher Scientific | S504501AS | magnetic stirrer |
Riferimenti
- Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).
- Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling. Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).
- Simpson, R. J. Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation. Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).
- Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation. J Cell Biol. 86 (1), 21-28 (1980).
- Philips, M. R., et al. Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes. Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).
- Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution. Cancer Res. 20, 397-402 (1960).
- Hunter, M. J., Commerford, S. L. Pressure homogenization of mammalian tissues. Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).
- Wallach, D. F., Kamat, V. B. Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).
- Birckbichler, P. J. Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation. TCA manual / Tissue Culture Association. 3 (3), 653-654 (1977).
- Brock, T. G., Paine, R., Peters-Golden, M. Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells. J Biol Chem. 269 (35), 22059-22066 (1994).
- Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation. FEBS Letters. 2 (1), (1968).
- Dai, Q., et al. Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).
- Wynne, J. P., et al. Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector. J Cell Biol. , (2012).
- Zhou, M., et al. VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking. J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).
- Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).
- Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46. Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).
- Annis, M. G., et al. Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event. Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).
- Berkowitz, S. A., Wolff, J. Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins. J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).
