Kväve kavitation och differentiell centrifugering tillåter övervakning fördelningen av perifera membranproteiner på odlade celler
Summary
Här presenterar vi protokoll för tvättmedel-fri homogenisering av odlade däggdjursceller baserat på kväve kavitation och efterföljande separation av cytosoliska och membran-bundna proteiner av ultracentrifugering. Denna metod är idealisk för övervakning av uppdelning av perifera membranproteiner mellan lösliga och membran fraktioner.
Abstract
Odlade celler är användbara för att studera subcellulär fördelningen av proteiner, inklusive perifera membranproteiner. Genetiskt kodade fluorescently har märkta proteiner revolutionerat studiet av subcellulär protein distribution. Det är dock svårt att kvantifiera distribution med fluorescerande mikroskopi, särskilt när proteiner är delvis cytosoliska. Dessutom är det ofta viktigt att studera endogena proteiner. Biokemiska analyser såsom immunoblots förblir den gyllene standarden för kvantifiering av protein fördelningen efter subcellulär fraktionering. Det finns kommersiella kit som syftar till att isolera cytosoliska eller vissa membran fraktioner, bygger de flesta av dessa kit på extraktion med rengöringsmedel, som kan vara olämpliga för att studera perifera membranproteiner som utvinns enkelt från membran. Här presenterar vi ett tvättmedel-fritt protokoll för cellulära homogenisering av kväve kavitation och efterföljande separation av cytosoliska och membran-bundna proteiner av ultracentrifugering. Vi bekräftar separation av subcellulär organeller i lösliga och pellet fraktioner över olika celltyper och jämföra protein utvinning bland flera gemensamma icke-diskmedel-baserade mekaniska homogenisering metoder. Bland flera fördelar med kväve är kavitation överlägsen effektivitet av cellulära störning med minimal fysisk och kemisk skada känsliga organeller. Kombinerat med ultracentrifugering, kväve kavitation är en utmärkt metod att undersöka skiftet av perifera membranproteiner mellan cytosoliska och membran fraktioner.
Introduction
Cellproteiner kan delas in i två klasser: de som är associerade med membran och de som inte är. Icke-membran associerade proteiner finns i cytosolen, nukleoplasman och lumina av organeller såsom det endoplasmatiska retiklet (ER). Det finns två klasser av membran-associerade proteiner, integrerad och perifera. Integrerad membranproteiner är också känd som transmembrana proteiner eftersom ett eller flera segment i kedjan polypeptid spänner membranet, vanligtvis som en α-helix består av hydrofoba aminosyror. Transmembrana proteiner infogas co-translationally membran under deras biosyntes och förblir så konfigurerade tills de är kataboliseras. Perifera membranproteiner drivs sekundärt till membran, vanligtvis till följd av posttranslationella modifieringen med hydrofoba molekyler såsom lipider. I motsats till integrerad membranproteiner, föreningen av perifera membranproteiner med cellmembran är reversibel och kan regleras. Många perifera membranet proteiner funktion i signalvägar och reglerade association med membran är en mekanism för att aktivera eller hämma en väg. Ett exempel av en signalmolekyl som är en perifer membranprotein är de små GTPase, RAS. Efter en serie av post-translationella modifieringar som inkluderar modifiering med en farnesyl lipid, infogar modifierad C-terminus en mogen RAS-protein i cytoplasmiska bipacksedeln av cellulära membran. Plasmamembranet är bestämt, där RAS engagerar sina nedströms effektor RAF1. För att förhindra konstitutiv aktivering av mitogen-aktiverat protein kinase (MAPK), finns flera nivåer av kontroll över RAS. Förutom rendering RAS inaktiva av screening GTP till BNP, kan aktiv RAS också frigöras från plasmamembranet av modifieringar eller interaktioner med solubilizing faktorer för att hämma signalering. Även om fluorescerande levande imaging ger cellbiologer möjlighet att följa subcellulär lokalisering av fluorescerande protein-taggade perifera membranet proteiner1, återstår det ett kritiskt behov att utvärdera membran sammanslutning av endogena proteiner semi kvantitativt med enkel biokemiska metoder.
Ordentlig biokemiska utvärderingen av protein partitionering mellan membran och lösliga fraktioner är kritiskt beroende av två faktorer: cellulär homogenisering och effektiv separation av membran och lösliga fraktioner. Även om vissa protokoll, inklusive de mest använda kommersialiserade kit, är beroende av diskmedel-baserade cell homogenisering, kan dessa metoder fördunkla analys genom att extrahera membranproteiner in i löslig fas2. Således ger icke-tvättmedel baserat, mekaniska metoder för cell störningar renare resultat. I området i närheten finns det flera metoder för mekaniska störningar i cellerna odlas i kultur eller skördas från blod eller organ. Dessa inkluderar Dounce homogenisering, fin nål störningar, kullager homogenisering, ultraljudsbehandling och kväve kavitation. Här vi utvärdera kväve kavitation och jämföra det med andra metoder. Kväve kavitation är beroende av kväve som är upplöst i cytoplasman i celler under högt tryck. Efter Jämviktstiden utsätts plötsligt cellsuspensionen till atmosfärstryck så att kväve bubblor bildas i cytoplasman som riv cellen till följd av deras gasutveckling. Om trycket är tillräckligt högt, kväve gasutveckling kan störa den nucleus3 och membran bundna organeller som lysosomer4. Men om trycket hålls tillräckligt låg, kommer dykarsjukan störa plasmamembranet och ER men inte andra organeller, därmed spilla både cytosol och intakt cytoplasmiska organeller i Homogenatet som designeras den cavitate5. Av denna anledning är kväve kavitation metoden för val av isolera organeller som lysosomer och mitokondrier.
Men är det också ett utmärkt sätt att förbereda en Homogenatet som enkelt kan delas in i membranet och lösliga fraktioner. Tryckkärlet (hädanefter kallad ”bomben”) används under kavitation består av ett tjockt rostfritt stål hölje som tål högt tryck, med ett inlopp för leverans av kvävgas från en tank och en outlet-port med en justerbar avtappningsventil.
Kväve kavitation har använts för cell homogenisering sedan 1960-talet6. I 1961, jägaren och Commerfold7 etablerade kväve kavitation som ett hållbart alternativ för däggdjursvävnader störningar. Sedan dess har forskare har anpassat tekniken till olika celler och vävnader med framgång, och kväve kavitation har blivit en stapelvara i flera program, inklusive membran beredning8,9, kärnor och organell förberedelser10,11, och labila biokemiska extraktion. För närvarande, använder cellbiologer oftare andra metoder av cell homogenisering eftersom fördelarna med kväve homogenisering inte har varit allmänt annonserat, kväve bomber är dyra och det finns en missuppfattning att ett relativt stort antal celler är krävs. Protokoll för kväve kavitation att uppnå cell-fri homogenates med intakt kärnor inte har publicerats, och i den publicerade utvärderingar volymer av 20 mL cellsuspension användes. För att anpassa denna klassisk teknik för att passa aktuella krav som arbetar med småskaliga prover, presenterar vi ett modifierat protokoll av kväve kavitation utformats speciellt för odlade celler. Efter kväve kavitation, Homogenatet separeras i lösliga (S) och membran (P) fraktioner av differentiell centrifugering, först med en låg hastighet spin ta bort kärnor och obruten celler, och sedan med en snabb spinn (> 100 000 x g) att skilja hinnor från den lösliga fraktionen. Vi analysera effektiviteten av separation med immunoblots och jämför kväve kavitation med andra mekaniska störningar tekniker. Vi undersöker också den osmotiska effekten av homogenisering buffert under kväve kavitation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fördelarna med kväve kavitation över andra metoder för mekaniska störningar är mångfaldiga. Kanske är mest betydande fördelen dess förmåga att skonsamt men effektivt homogenisera exemplar. Dekompression kyler prover istället för att generera lokala värme skador fysikaliska principer som ultraljud och friktion/klippning baserade teknik. Kavitation är också extremt effektiva på störa plasmamembranet. Eftersom kväve bubblor genereras inom varje enskild cell vid dekompression, kavitation processen begräns…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av GM055279, CA116034 och CA163489.
Materials
| Cell Disruption Vessel (45 mL) | Parr Instrument | 4639 | Nitrogen cavitation Bomb |
| Dounce homogenizer (2 mL) | Kontes | 885300-0002 | Dounce pestle and tube |
| U-100 Insulin Syringe 28G½ | Becton Dickinson | 329461 | Needle |
| Atg12 antibody | Santa Cruz | 271688 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-actin antibody | Santa Cruz | 47778 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-tubulin antibody | DSHB | E7-s | Mouse antibody, use at 1:5000 dilution |
| Calnexin antibody | Santa Cruz | 23954 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Calregulin antibody | Santa Cruz | 373863 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Catalase antibody | Santa Cruz | 271803 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| CIMPR antibody | Abcam | 124767 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| EEA1 antibody | Santa Cruz | 137130 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| EGFR antibody | Santa Cruz | 373746 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F0-ATPase antibody | Santa Cruz | 514419 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F1-ATPase antibody | Santa Cruz | 55597 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Fibrillarin antibody | Santa Cruz | 374022 | Mouse antibody, use at 1:200 dilution |
| Golgin 97 antibody | Santa Cruz | 59820 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| HDAC1 antibody | Santa Cruz | 81598 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Hexokinase 1 antibody | Cell Signaling Technology | 2024S | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Lamin A/C antibody | Santa Cruz | 376248 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| LAMP1 antibody | DSHB | H4A3-c | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Na+/K+ ATPase antibody | Santa Cruz | 48345 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab7 antibody | Abcam | 137029 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab9 antibody | Thermo | MA3-067 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RCAS1 antibody | Santa Cruz | 398052 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RhoGDI antibody | Santa Cruz | 360 | Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution |
| Ribosomal protein S6 antibody | Santa Cruz | 74459 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Sec61a antibody | Santa Cruz | 12322 | Goat antibody, use at 1:1000 dilution |
| Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 349622 | Sample tube for ultracentrifugation |
| TLK-100.3 rotor | Beckman Coulter | 349481 | rotor for ultracentrifugation |
| Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 364300 | ultracentrifuge |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11697498001 | protease inhibitors |
| Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade | Corning | 353089 | large cell scraper |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-57SIX | micro stir bar |
| Ceramic-Top Magnetic Stirrer | Fisher Scientific | S504501AS | magnetic stirrer |
Riferimenti
- Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).
- Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling. Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).
- Simpson, R. J. Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation. Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).
- Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation. J Cell Biol. 86 (1), 21-28 (1980).
- Philips, M. R., et al. Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes. Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).
- Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution. Cancer Res. 20, 397-402 (1960).
- Hunter, M. J., Commerford, S. L. Pressure homogenization of mammalian tissues. Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).
- Wallach, D. F., Kamat, V. B. Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).
- Birckbichler, P. J. Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation. TCA manual / Tissue Culture Association. 3 (3), 653-654 (1977).
- Brock, T. G., Paine, R., Peters-Golden, M. Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells. J Biol Chem. 269 (35), 22059-22066 (1994).
- Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation. FEBS Letters. 2 (1), (1968).
- Dai, Q., et al. Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).
- Wynne, J. P., et al. Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector. J Cell Biol. , (2012).
- Zhou, M., et al. VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking. J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).
- Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).
- Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46. Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).
- Annis, M. G., et al. Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event. Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).
- Berkowitz, S. A., Wolff, J. Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins. J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).
