Azot kavitasyon ve diferansiyel Santrifüjü sağlar periferik membran proteinlerinin kültürlü hücrelerdeki dağılımını izlemek için
Summary
Burada iletişim kuralları için deterjan-Alerjik homojenizasyon kültürlü memeli hücrelerinin azot kavitasyon ve sonraki sitozolik ve membran bağlı proteinler ayrılması ultrasantrifüj tarafından dayalı mevcut. Bu yöntem periferik membran proteinlerinin çözünür arasındaki bölümleme izlemek için idealdir ve membran kesirler.
Abstract
Kültürlü hücrelerin periferik zar proteinleri de dahil olmak üzere proteinlerin hücre altı dağıtım eğitimi için yararlıdır. Genetik olarak kodlanmış fluorescently tagged proteinler hücre altı protein dağıtım çalışmanın devrim. Ancak, özellikle proteinler kısmen sitozolik olduğunda floresan mikroskopisi, dağılımıyla ölçmek zordur. Ayrıca, bu kez endojen proteinler çalışma önemlidir. İmmunoblots miktar protein dağıtım sonra hücre altı ayırma için altın standart kalır gibi biyokimyasal deneyleri. Sitozolik veya belirli membran kesirler ayırma amacı ticari kitleri olmakla birlikte, bu kitleri çoğunu ayıklama membranlar kolayca ayıklanır periferik membran proteinlerinin eğitim için uygun olmayan deterjanlar ile temel alır. Burada bir deterjan-Alerjik protokol hücresel homojenizasyon için azot kavitasyon ve sonraki ayrılması sitozolik ve membran bağlı proteinler tarafından ultrasantrifüj tarafından mevcut. Biz hücre altı organelleri çözünür içinde ayrılması ve Pelet kesirler farklı hücre türleri arasında onaylayın ve protein ayıklama birkaç ortak mekanik homojenizasyon deterjan tabanlı olmayan yöntemler arasında karşılaştırın. Azot birkaç avantajları arasında kavitasyon hassas organelleri en az fiziksel ve kimyasal zarar ile hücresel bozulma üstün verimliliği olduğunu. Ultrasantrifüj ile birlikte, azot kavitasyon sitozolik arasındaki periferik membran proteinlerinin kayma incelemek için mükemmel bir yöntem olduğunu ve membran kesirler.
Introduction
Hücresel proteinler iki sınıfa ayrılabilir: membranlar ve olmayanlar ile ilişkili olan o. Sigara-membran ilişkili proteinler sitozol, nucleoplasm ve endoplazmik retikulum (ER) gibi organellerin lumina bulunur. Membran ilişkili proteinler, integral ve periferik iki sınıf vardır. Bir veya daha fazla parçadan polipeptid zinciri yayıldığı için membran, genellikle bir α-helix hidrofobik amino asitleri oluşur olarak integral membran proteinlerinin transmembran proteinler da verilir. Transmembran proteinler membran onların sentezi sırasında co-translationally takılan ve onlar catabolized kadar çok yapılandırılmış kalır. Periferik membran proteinlerinin ikincil olarak membranlar, genellikle bir sonucu olarak post-translational değişiklik lipidler hidrofobik moleküllerin ile tahrik edilmektedir. İntegral membran proteinlerinin, aksine periferik membran proteinlerinin dernek hücresel membranlar ile geri alınabilir ve düzenlenmiş olması. Birçok çevresel membran proteinleri işlev sinyal yolları ve membranlar ile düzenlenmiş Derneği etkinleştirme veya inhibe bir yol için bir mekanizmadır. Periferik membran proteinidir bir sinyal molekülü küçük GTPazlar, RAS örneğidir. Bir dizi değişiklik ile farnesyl lipid içeren translasyonel modifikasyonlar sonra değiştirilmiş C-terminus olgun bir RAS protein hücre membran sitoplazmik broşürü ekler. Özellikle, plazma zarı nerede onun aşağı akım efektör RAF1 RAS yürütmektedir olduğunu. Mitojenle-aktive protein kinaz (MAPK) aktivasyonu bünye önlemek için birden çok düzeyde denetimler RAS yerdesiniz. RAS etkin olmayan GTP GSYİH hidrolize tarafından render yanı sıra, etkin RAS da plazma zarı antenler, deðiþiklikler veya amil-e doğru sinyal inhibe çözücü ile etkileşimler tarafından azat edilebilir. Floresan canlı görüntüleme hücre biyologları protein öğesini floresan periferik membran protein1hücre altı lokalizasyonu gözlemlemek için fırsat tanıyor olsa da, orada kalır membran Derneği değerlendirmek için kritik bir ihtiyaç basit biyokimyasal yaklaşımlarla yarı kantitatif endojen proteinler.
Membran ve çözünür kesirler arasında protein bölümleme doğru biyokimyasal değerlendirme eleştirel iki faktöre bağlıdır: hücresel homojenizasyon ve membran ve çözünür kesirler verimli ayrılması. En yaygın olarak kullanılan ticari kitleri dahil olmak üzere bazı iletişim kuralları üzerinde deterjan tabanlı cep homojenizasyon bağlı olsa da, bu yöntemlerin çözünür aşama2membran proteinlerinin ayıklayarak analiz karartmak. Buna göre deterjan bazlı, mekanik yöntemler hücre bozulma temiz sonuçlar sağlar. Hücre kültüründe yetiştirilen veya kan ya da organ hasat mekanik bozulma birkaç yöntem vardır. Bu Dounce Homojenizasyon, ince iğne bozulma, rulman Homojenizasyon, sonication ve azot kavitasyon içerir. Burada azot kavitasyon değerlendirmek ve diğer yöntemler için karşılaştırın. Azot kavitasyon yüksek basınç altında hücre sitoplazma içinde çözünmüş azot kullanır. Öyle ki onların coşku bir sonucu olarak hücre açık gözyaşı sitoplazmada azot kabarcıklar oluşur denge sonra hücre süspansiyon aniden atmosferik basınca maruz kalmaktadır. Basınç yeterince yüksek ise azot neşesinden çekirdeği3 bozabilir ve membran organelleri gibi organellerin4bağlı. Ancak, eğer basınç yeterince düşük tutulur, dekompresyon plazma zarı ve ER ama değil diğer organelleri böylece sitozol ve bozulmamış sitoplazmik organelleri cavitate5atanır homogenate dökülüp, bölebilir. Bu nedenle, azot kavitasyon organelleri gibi organellerin ve mitokondri izole için tercih yöntemdir.
Ancak, membran ve çözünür kesirler kolayca ayrılabilen bir homogenate hazırlama mükemmel bir şekilde de öyle. Bir tank ve bir çıkış bağlantı noktası bir Ayarlanabilir deşarj Vana ile azot gazı teslimi için bir giriş ile yüksek basınç dayanıklı kalın paslanmaz çelik kasa, kavitasyon sırasında kullanılan (bundan böyle “bomba” olarak da adlandırılır) basınç gemi oluşur.
Azot kavitasyon hücre homojenizasyon 1960’larda6beri kullanılmaktadır. 1961 yılında, avcı ve Commerfold7 memeli doku bozulması için uygun bir seçenek olarak azot kavitasyon kurdu. O zamandan beri araştırmacılar çeşitli hücre ve dokulara başarı ile tekniği adapte olması ve azot kavitasyon membran hazırlık8,9, çekirdek ve organel dahil olmak üzere birden çok uygulama bir elyaf haline gelmiştir Hazırlık10,11ve değişken biyokimyasal çıkarma. Şu anda, hücre biyologları daha sık hücre homojenizasyon diğer yöntemleri azot homojenizasyon faydaları değil yaygın olarak reklamı, azot bomba pahalıdır ve hücre nispeten büyük bir sayıdır bir yanlış anlaşılma olduğunu çünkü istihdam Gerekli. Boş hücre homogenates olduğu gibi çekirdek ile elde etmek azot kavitasyon protokollerde yayınlanmadı ve en Yayınlanan değerlendirme hücre süspansiyon, 20 mL hacimli kullanılmıştır. Küçük ölçekli örnekler ile çalışma geçerli uygun için klasik bu tekniği adapte, azot kavitasyon kültürlü hücreler için özel olarak tasarlanmış değiştirilmiş bir protokol mevcut. Azot kavitasyon sonra homogenate çözünür (S) ve membran (P) kesirler fark Santrifüjü tarafından ilk çekirdeği ve kesilen hücreleri kaldırmak için bir düşük hızlı spin ile ve sonra bir yüksek hızlı spin ile ayrılır (> 100.000 x g) ayırmak için membranlar çözünür kesir üzerinden. Biz immunoblots ile ayırma verimliliğini analiz ve azot kavitasyon diğer mekanik bozulma teknikleri ile karşılaştırın. Azot kavitasyon sırasında Ayrıca homojenizasyon arabellek ozmotik etkisini araştırmak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Manifold gibi diğer yöntemler üzerinde azot kavitasyon mekanik bozulma avantajları vardır. Belki de en önemli yararı yavaşça henüz verimli bir şekilde numuneler homojenize yeteneğidir. Dekompresyon cools örnekleri oluşturma Yerel Isıtma hasar yerine fiziksel prensipleri Ultrasonik gibi ve sürtünme/kesme teknikleri dayalı. Kavitasyon Ayrıca son derece plazma zarı bozan etkilidir. Azot kabarcıklar dekompresyon, kavitasyon işleminin üzerine tek tek her hücre içinde oluşturulan sınırlı olduğunda…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser, GM055279, CA116034 ve CA163489 tarafından finanse edildi.
Materials
| Cell Disruption Vessel (45 mL) | Parr Instrument | 4639 | Nitrogen cavitation Bomb |
| Dounce homogenizer (2 mL) | Kontes | 885300-0002 | Dounce pestle and tube |
| U-100 Insulin Syringe 28G½ | Becton Dickinson | 329461 | Needle |
| Atg12 antibody | Santa Cruz | 271688 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-actin antibody | Santa Cruz | 47778 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-tubulin antibody | DSHB | E7-s | Mouse antibody, use at 1:5000 dilution |
| Calnexin antibody | Santa Cruz | 23954 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Calregulin antibody | Santa Cruz | 373863 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Catalase antibody | Santa Cruz | 271803 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| CIMPR antibody | Abcam | 124767 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| EEA1 antibody | Santa Cruz | 137130 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| EGFR antibody | Santa Cruz | 373746 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F0-ATPase antibody | Santa Cruz | 514419 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F1-ATPase antibody | Santa Cruz | 55597 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Fibrillarin antibody | Santa Cruz | 374022 | Mouse antibody, use at 1:200 dilution |
| Golgin 97 antibody | Santa Cruz | 59820 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| HDAC1 antibody | Santa Cruz | 81598 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Hexokinase 1 antibody | Cell Signaling Technology | 2024S | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Lamin A/C antibody | Santa Cruz | 376248 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| LAMP1 antibody | DSHB | H4A3-c | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Na+/K+ ATPase antibody | Santa Cruz | 48345 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab7 antibody | Abcam | 137029 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab9 antibody | Thermo | MA3-067 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RCAS1 antibody | Santa Cruz | 398052 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RhoGDI antibody | Santa Cruz | 360 | Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution |
| Ribosomal protein S6 antibody | Santa Cruz | 74459 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Sec61a antibody | Santa Cruz | 12322 | Goat antibody, use at 1:1000 dilution |
| Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 349622 | Sample tube for ultracentrifugation |
| TLK-100.3 rotor | Beckman Coulter | 349481 | rotor for ultracentrifugation |
| Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 364300 | ultracentrifuge |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11697498001 | protease inhibitors |
| Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade | Corning | 353089 | large cell scraper |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-57SIX | micro stir bar |
| Ceramic-Top Magnetic Stirrer | Fisher Scientific | S504501AS | magnetic stirrer |
Riferimenti
- Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).
- Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling. Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).
- Simpson, R. J. Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation. Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).
- Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation. J Cell Biol. 86 (1), 21-28 (1980).
- Philips, M. R., et al. Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes. Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).
- Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution. Cancer Res. 20, 397-402 (1960).
- Hunter, M. J., Commerford, S. L. Pressure homogenization of mammalian tissues. Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).
- Wallach, D. F., Kamat, V. B. Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).
- Birckbichler, P. J. Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation. TCA manual / Tissue Culture Association. 3 (3), 653-654 (1977).
- Brock, T. G., Paine, R., Peters-Golden, M. Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells. J Biol Chem. 269 (35), 22059-22066 (1994).
- Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation. FEBS Letters. 2 (1), (1968).
- Dai, Q., et al. Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).
- Wynne, J. P., et al. Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector. J Cell Biol. , (2012).
- Zhou, M., et al. VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking. J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).
- Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).
- Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46. Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).
- Annis, M. G., et al. Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event. Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).
- Berkowitz, S. A., Wolff, J. Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins. J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).
