Une méthode pour évaluer les effets de la bactériocine sur le microbiota intestinal des souris
Summary
On pense que les bactériocines jouent un rôle clé dans la définition de la diversité microbienne dans différentes niches écologiques. Ici, nous décrivons une procédure efficace pour évaluer comment les bactériocines affectent la composition de microbiota intestinal dans un modèle animal.
Abstract
Des questions très intriguantes se posent avec notre connaissance approfondie de la composition des microbiotes intestinaux et de la relation avec la santé, en particulier en ce qui concerne les facteurs qui contribuent au maintien de l'équilibre de la population. Cependant, il existe des méthodologies disponibles limitées pour évaluer ces facteurs. Les bactériocines sont des peptides antimicrobiens produits par de nombreuses bactéries qui peuvent conférer un avantage concurrentiel pour l'acquisition d'aliments et / ou l'établissement de niche. De nombreuses souches probiotiques de bactéries lactiques (LAB) ont un grand potentiel pour promouvoir la santé humaine et animale en empêchant la croissance de pathogènes. Ils peuvent également être utilisés pour l'immuno-modulation, car ils produisent des bactériocines. Cependant, l'activité antagoniste des bactériocines est normalement déterminée par des essais biologiques de laboratoire dans des conditions bien définies mais simplifiées par rapport à l'environnement intestinal complexe chez les humains et les animaux, où les bactéries sont confrontées à des influences multifactorielles de l'hôte et des centaines d'espèces microbiennes sHaring le même créneau. Ce travail décrit une procédure complète et efficace pour évaluer l'effet D'une variété de bactériocines avec différentes spécificités cibles dans un système murin. Les changements dans la composition de microbiota au cours du traitement par la bactériocine sont surveillés à l'aide du séquençage d'ADNr 16S de composition. Notre approche utilise à la fois les producteurs de bactériocines et leurs mutants isogènes non productifs de bactériocines, ce dernier permettant de distinguer les modifications liées à la bactériocine liées aux modifications du microbiota liées à la bactériocine. L'extraction de l'ADN fécale et les méthodes de séquençage de l'ADNr 16S sont cohérentes et, conjointement avec la bioinformatique, constituent une procédure puissante pour trouver des changements faibles dans les profils bactériens et pour établir des corrélations, en termes de concentration de cholestérol et de triglycérides, entre les populations bactériennes et les marqueurs de santé. Notre protocole est générique et peut donc être utilisé pour étudier d'autres composés ou nutriments susceptibles de modifier le micro hôteRobiota composition, soit lors de l'étude de la toxicité ou des effets bénéfiques.
Introduction
Les bactériocines sont des peptides antimicrobiens produits par une large gamme d'espèces bactériennes 1 , 2 . Ces composés et leurs producteurs, en particulier LAB, ont été explorés et exploités dans le monde entier pendant des décennies pour leurs applications potentielles dans la conservation des aliments et la médecine 3 . Plusieurs bactériocines sont connues pour tuer les pathogènes importants, y compris les espèces de Listeria, Enterococcus, Staphylococcus et Bacillus . Certaines bactériocines ont même la capacité de moduler la réponse immunitaire 4 . De nombreuses bactériocines ont des spectres relativement étroits, une propriété qui est très appréciée dans certaines applications. Par exemple, certaines bactériocines à spectre étroit peuvent être utilisées pour diriger une activité spécifique contre des groupes sélectionnés de bactéries problématiques, sans beaucoup de perturbation sur la flore commensale ou bénéfique partageant la même niche; Ceci est particulièrement essentiel dans l'environnement intestinal, Où de nombreux microbes bénéfiques prospèrent de manière interactive et dynamique 5 . Les bactériocines sont également très attrayantes pour une utilisation prophylactique ou probiotique, car elles peuvent supprimer la croissance des agents pathogènes, des pathobionts ou des bactéries opportunistes qui peuvent déséquilibrer l'homéostasie intestinale 6 , 7 .
En termes de nature et de propriétés physicochimiques, les bactériocines sont très diverses, car elles ont des structures différentes, des spécificités cibles, des modes d'action, etc. La plupart des bactériocines ont été étudiées très en détail dans des milieux in vitro , mais très peu ont été testés dans les aliments Les matrices 8 , 9 ou in vivo, telles que dans un intestin d'animal 6 , 10 . Les propriétés in vitro peuvent différer dans une grande mesure lorsqu'elles sont évaluées in vivo en raison de la complexité oF l'environnement intestinal et aussi à des effets involontaires putatifs sur les bactéries bénéfiques. La plupart des probiotiques sont LAB. Ils produisent une gamme d'autres métabolites, y compris les acides gras à chaîne courte, qui influent sur la physiologie de l'hôte, ainsi que pour démontrer les propriétés antimicrobiennes envers certaines bactéries. Par conséquent, dans le cas des souches probiotiques qui produisent des bactériocines, il est préférable d'établir des analyses réalistes, comme des animaux sains avec un microbiota normal.
Dans la présente étude, nous fournissons une stratégie qui permet d'évaluer l'effet de différentes souches productrices de bactériocines, dont les bactériocines ont des spectres inhibiteurs différents, sur des souris saines. Notre stratégie comprend l'alimentation de souris avec des mutants isogènes non bactériociniques, ce qui permet de différencier les effets médiés par la bactériocine des effets induits par la bactériocine. Le séquençage du 16S rDNA permet de suivre les changements dynamiques de la population bactérienne dans l'intestin. SubsUne analyse statistique équitable déchiffre les corrélations entre les espèces bactériennes et aussi entre les espèces bactériennes et les paramètres physiologiques mesurés ( p. Ex., Poids corporel, paramètres biochimiques sériques, etc. ). Nous croyons que le protocole présenté dans cette étude s'applique également à d'autres applications probiotiques ou prébiotiques au-delà de l'étude des bactériocines chez les animaux vivants.
Protocol
Representative Results
Discussion
La procédure décrite ici a été utilisée pour déterminer si les changements dans le microbiote sont liés à la santé ou à l'âge. Différentes parties du protocole sont importantes, mais parmi celles-ci, l'échantillonnage des excréments, le choix du fragment d'ADN pour être séquencé et analysé, et l'analyse de l'extraction de l'ADN et de l'analyse bioinformatique pourraient certainement être les points les plus critiques. L'échantillonnage est crucial car, pour des raisons…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs souhaitent remercier la mobilité coordonnée de chercheurs de l'EEE Grant NILS Science et Sustainability Coordination (référence 017-ABEL-CM-2013). CB et GP-M. Ont été soutenus par la subvention AGL2015-70487-P du ministère espagnol de l'Économie et de la Compétitivité. OCOU et DBD ont été soutenus par un programme de bourses stratégiques pour la recherche en sciences alimentaires de l'Université norvégienne des sciences de la vie (projet NMBU) (projet 1205051025). Nous souhaitons également remercier Inmaculada Noguera pour son aide aux soins et à l'échantillonnage des animaux et à Jésus Dehesa pour son aide pour assurer la disponibilité de matériel de laboratoire dans l'établissement d'élevage. Nous apprécions également le professeur Lars-Gustav Snipen pour ses conseils sur les statistiques.
Materials
| Balb/c mice (female) | Harlan | Mice should be 6 – 8 weeks of age | |
| Plastic Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| Brain-Heart-Infusion broth | Conda | 1400.00 | |
| European Bacteriological Agar | Pronadisa | 1800.00 | |
| Agarose D1 Low EEO | Pronadisa | 8010.00 | |
| 1XTAE buffer | Thermo Scientific | 15558042 | |
| MRS broth | Difco | 288130 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| scale | Mettler Toledo | PB602-S | |
| sterile forceps | Levantina de Laboratorios S.L. | 260-3710014 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Hermle | Z383K | |
| sodium chloride | AppliChem Panreac | 121659.1211 | |
| Realpure SSS Kit | Real Life Science Solutions, Durviz, Spain | RBME04 (300 ml) | |
| Isopropanol | AppliChem Panreac | 131090.1611 | |
| Ethanol | AppliChem Panreac | 131086.1214 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter Genomics, USA | A63881 (60 ml) | |
| PerfeCta NGS library quantification kit | Quanta BioSciences, Maryland, USA | 733-2300 | |
| MiSeq v3 reagent kit | Illumina, San Diego, California, USA | MS-102-3003 | |
| Primers for 16S rRNA gene amplification | Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ and 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’ | ||
| Nextera XT Index kit | FC-131-1002 | Indices and Illumina sequencing adaptors | |
| Micropestle for 1.5 ml tubes, Eppendorf / Sigma , Ref. | Sigma | Z317314-1PAK | |
| Glass beads, 0.1 mm diameter | Biospec Products | 11079-101 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609.25 | |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International Inc. | 19-040 | |
| mutanolysin | Sigma | M9901-10KU | |
| lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| proteinase K | Roche | 3115887001 | |
| Rnase A | Sigma | R4875 |
Riferimenti
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