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Neuroscienze

Imagerie des cellules du Cortex cérébral primaire à l’aide d’un système de Culture 2D en direct

Published: August 09, 2017
doi:
10.3791/56063
, , , ,
1Brain Institute,Federal University of Rio Grande do Norte, 2Department of Biosystems Science and Engineering,ETH Zurich, 3The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience,Johns Hopkins University

Summary

L’imagerie Live est un outil puissant pour étudier les comportements cellulaires en temps réel. Nous décrivons ici un protocole pour le Time-lapse vidéo-microscopie des cellules du cortex cérébral primaire qui permet un examen détaillé des phases adoptées au cours de la progression de la lignée du primaire des cellules souches neurales au différenciée des neurones et cellules gliales.

Abstract

Au cours du développement du cortex cérébral, cellules progénitrices subissent plusieurs séries de symétriques et asymétriques des divisions cellulaires pour générer de nouveaux géniteurs ou neurones mitotiques. Plus tard, quelques progéniteurs basculer vers un sort gliogenic, ajoutant à la population astrocyte et oligodendrocyte. À l’aide de Time-lapse vidéo-microscopie des cultures de cellules primaires de cortex cérébral, il est possible d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires qui contrôlent le mode de division cellulaire et les paramètres de cycle cellulaire des cellules progénitrices. De même, le sort des cellules postmitotiques peut être examiné à l’aide de protéines spécifiques des cellules fluorescentes journaliste ou études d’imagerie immunocytochimie. Plus important encore, toutes ces caractéristiques peuvent être analysées au niveau unicellulaire, permettant l’identification de cellules souches s’est engagé à la génération de types spécifiques de cellules. Manipulation de l’expression génique peut également être effectuée utilisant virale véhiculée par transfection, permettant l’étude des phénomènes autonome-cellule et cellule-non-autonomes. Enfin, l’utilisation de protéines fluorescentes fusion permet l’étude de la distribution symétrique et asymétrique des protéines sélectionnées au cours de la division et la corrélation avec le destin des cellules-filles. Nous décrivons ici la méthode vidéo-microscopie Time-lapse pour cellules murines primaire cortex cérébral pour plusieurs jours d’images et d’analyser le mode de division cellulaire, longueur du cycle cellulaire et le destin des cellules nouvellement créées. Nous décrivons également une méthode simple pour transfecter de cellules progénitrices, qui peuvent être appliqués pour manipuler les gènes d’intérêt ou simplement étiqueter des cellules avec des protéines de journaliste.

Introduction

Des cellules souches neurales (NSC) générer des neurones et des cellules de macroglial au cours du développement du cortex cérébral. Au début-exocytosis, CNS subissent plusieurs séries de la division cellulaire symétrique et élargir le bassin de l’ancêtre. Ensuite, les CNS divisent asymétriquement pour générer des neurones directement ou indirectement par le biais d’intermédiaires1. Seulement à mi – à fin-exocytosis, progéniteurs commutateur pour générer les astrocytes et oligodendrocytes2,3,4. Cependant, les mécanismes complets qui contrôlent la prolifération cellulaire et la différenciation, ainsi que la contribution des progéniteurs sort restreints à la génération de types uniques de neurones ou cellules macroglial restent un sujet de débat intense4,5,6. Le potentiel des CNS corticales individuels pour générer des neurones, les astrocytes et les oligodendrocytes a été étudiée in vitro et in vivo à l’aide d’une multitude de techniques telles que : vivre l’imagerie en single-cell cultures7,8,9,10,11,12,13; vivre d’imagerie à haute densité de cultures cultures3,14,15; vivre d’imagerie en tranche cultures16,17,18; clonale analyse virale véhiculée par vector étiquetage génétique dans les cultures à haute densité14,15,19,20,21; analyse clonale in vivo à l’aide de rétrovirus22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; et analyse clonale in vivo à l’aide des animaux transgéniques,34.

Chacune de ces techniques présente des avantages et des inconvénients. Par exemple, in vivo le traçage de lignée est sensible à la mettre et fendage erreurs3, aboutissant à des conclusions contradictoires quant au potentiel des progéniteurs corticales individuels. En outre, les études in vitro et in vivo sur l’étiquetage des cellules progénitrices au début-points dans le temps et analyse postérieure des lignages cellulaires peut être influencée par la présence non détectée de mort cellulaire au cours de la lignée-progression35. Par conséquent, un système approprié d’analyser le potentiel des CNS unique doit permettre l’identification de toutes les cellules générées, ainsi que la caractérisation appropriée de destins de cellules au sein de la lignée. Combinaison de culture de cellules primaires et imagerie live fournit ce paramètre. À l’aide de la culture de cellule unique et microscopie vidéo Time-lapse, Temple et coll. ont montré l’interrupteur dans la lignée des progéniteurs individuels cortex cérébral de neurogenèse à gliogenesis11. Plus tard, ils ont utilisé le même système pour montrer que différents types de neurones sont générés à partir un seul ancêtre corticale12. Cependant, ce système présente une mise en garde importante : seulement 1 % des progéniteurs corticales isolées au début exocytosis générer des clones de 4 ou plus de descendance9. Après l’ajout de FGF2, la fréquence des cellules générant 4 ou plusieurs cellules augmente de 8 à 10 %9. Néanmoins, ce nombre est trop petit, étant donné que pratiquement tous les progéniteurs corticales sont prolifératives à ce stade. En outre, les effets potentiels de FGF2 sur sort-cahier des charges n’est pas exclus de36. Pour contourner ces limitations, nous avons utilisé des cultures de cellules haute densité favorisant la prolifération des deux ventriculaire (exprimant le Pax6) et de progéniteurs corticale sous-ventriculaire (exprimant le Tbr2)15. De plus, l’observation en temps réel de ces cultures a montré que plusieurs caractéristiques de la progression de lignée NSC sont reproduits dans ces conditions, tels que le mode de division cellulaire, allongement du cycle cellulaire, des cellules simples susceptibles de générer des neurones et des cellules gliales, entre autres,3,15. Plus récemment, nous avons également utilisé ce système pour montrer que CREB-signalisation affecte la survie cellulaire des neurones immatures cortex cérébral en souris37. Ainsi, nous croyons que Time-lapse vidéo-microscopie de murin du cortex cérébrale primaire les cellules cultivées à haute densité est un outil puissant et accessible afin d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la progression du cycle cellulaire, le mode de division cellulaire, la survie des cellules et la spécification des cellules sort. Ce dernier peut être réalisé à l’aide d’animaux transgéniques, ce qui permet l’identification des destins cellulaires spécifiques en temps réel38,39,40 ou l’utilisation d’études d’imagerie immunocytochimie3,38,41,42.

Ici, nous fournissons un protocole étape par étape pour préparer la culture cellulaire primaire cortex cérébral soutenant la prolifération des CNS et la génération suivante des neurones et des cellules macroglial. Nous discutons également l’utilisation de la transfection rétrovirale médiation pour manipuler l’expression des gènes des cellules individuelles, qui peuvent être identifiés et suivis au niveau de la cellule unique à l’aide de la microscopie vidéo Time-lapse. Ce protocole peut être utilisé pour étudier les cellules du cortex cérébral primaire isolés du début à la fin de l’exocytosis chez les rongeurs, mais quelques ajustements peuvent être nécessaires selon l’ étape14. CNS isolés provenant d’autres sources peuvent également être étudiés à l’aide de la microscopie vidéo Time-lapse de cultures 2D, mais le système de culture approprié doit être déterminé en comparant les comportements de cellulaire in vitro et in vivode38,43.

Protocol

All experiments involving live animals described in this protocol are conducted according to the National and International laws and were approved by the local University Animal Care and Use Committee (CEUA/UFRN), under the license 009/2014. The following protocol is performed in a sterile environment. Familiarity with basic cell culture is expected. 1. Dorsolateral Telencephalon Microdissection Prepare the dissection medium (100 mL): 98.5 mL Hank's Balanced Salt Solution (HBSS…

Representative Results

Primary cultures of cerebral cortex cells isolated from embryos E14 contain both progenitor and neuronal cells. During the period of imaging, progenitors undergo several rounds of cell division, increasing the number of cells (Figure 5 and Video Figure 1). Retroviral-mediated transfection of a few progenitor cells facilitates the identification of cell clones (F…

Discussion

Observation en temps réel des cellules du cortex cérébral primaire permet l’analyse de la prolifération cellulaire, le mode de division cellulaire, la longueur du cycle cellulaire, la différenciation cellulaire et cell survival3,14,15,37. Plus important encore, elle permet l’étude des lignées unicellulaires, conduisant à l’identification des phases intermédiaires adoptées au cou…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) et FAPERN (Fundação de Amparo Pesquisa do Rio Grande do Norte).

Materials

Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen Life Technologies 14175129
HEPES Sigma-Aldrich H3375-25G
Penicillin/streptomycin Gibco 15140122
Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) Gibco 12400-024
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10437028
Glucose Gibco A2494001
B27 Gibco 17504044
trypsin-EDTA (0.05%) Gibco 25300054
Paraformaldehyde Sigma 16005
Goat serum Sigma-Aldrich 69023
Triton X-100 VWR International Ltd. 306324N
Isoflurane Sigma 792632
anti-MAP2, mouse Sigma M4403
anti-GFP chicken Aves 0511FP12
DAPI Sigma D9542
Goat anti-mouse alexa 594 Invitrogen A11005
Goat anti-chicken alexa 488 Invitrogen A11039
ImageJ NIH
tTt ETH Zurich
Cell observer microscope Zeiss
Pasteur pipette
PBS
The Tracking Tool (tTt) software https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html download link
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Riferimenti

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Keywords: Live ImagingPrimary Cerebral Cortex Cells2D Culture SystemNeural Stem CellsNeuronsGlial CellsNeurodevelopmentCell LineageCell DivisionCell CycleCell GrowthEmbryonic BrainDorsolateral TelencephalonCell DissociationTrypsin-EDTAProliferation MediumPoly-D-lysine
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Landeira, B. S., Araújo, J. A. d. M., Schroeder, T., Müller, U., Costa, M. R. Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System. J. Vis. Exp. (126), e56063, doi:10.3791/56063 (2017).
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