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Neuroscienze

Bildgebung des primären Hirnrinde Zellen unter Verwendung einer 2D Kultursystem zu leben

Published: August 09, 2017
doi:
10.3791/56063
, , , ,
1Brain Institute,Federal University of Rio Grande do Norte, 2Department of Biosystems Science and Engineering,ETH Zurich, 3The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience,Johns Hopkins University

Summary

Live Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur zelluläre Verhaltensweisen in Echtzeit zu studieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Time-Lapse Video-Mikroskopie des primären Hirnrinde Zellen, die eine detaillierte Untersuchung der Phasen verordnet während der Linie Weiterentwicklung von primäre neurale Stammzellen zu differenzierten Neuronen und Glia ermöglichen.

Abstract

Während der Großhirnrinde Entwicklung durchlaufen Vorläuferzellen mehrere Runden von symmetrischen und asymmetrischen Zellteilungen, neue Vorfahren oder postmitotischen Neuronen zu generieren. Später wechseln Sie einige Stammväter in ein Gliogenic Schicksal, Hinzufügen der Astrozyten und Oligodendrozyt Bevölkerung. Mit Time-Lapse Video-Mikroskopie von primären Hirnrinde Zellkulturen, ist es möglich, die zellulären und molekularen Mechanismen, die Kontrolle der Zellteilung und Zellzyklus-Parameter der Vorläuferzellen zu studieren. In ähnlicher Weise kann das Schicksal der postmitotischen Zellen mit fluoreszierenden Reporter zellspezifische Proteine oder Post-imaging Immunocytochemistry untersucht werden. Noch wichtiger ist, können alle diese Funktionen Ebene der einzelligen, ermöglicht die Identifizierung von Vorfahren verpflichtet die Generation von bestimmten Zelltypen analysiert werden. Manipulation der gen-Expression kann auch mit viral-vermittelte Transfektion, ermöglicht die Untersuchung der Zelle-autonome und Zelle-nichtautonomen Phänomene durchgeführt werden. Schließlich ermöglicht die Verwendung von fluoreszierenden Fusionsproteine die Studie von symmetrischen und asymmetrischen Verteilung der ausgewählten Proteine während der Teilung und die Korrelation mit dem Schicksal der Tochterzellen. Hier beschreiben wir die Time-Lapse Video-Mikroskopie-Methode, um Bild primären Hirnrinde murinen Zellen für bis zu mehreren Tagen und die Art der Zellteilung, Zellzyklus Länge und Schicksal der neu erzeugten Zellen zu analysieren. Wir beschreiben auch eine einfache Methode um transfizieren Vorläuferzellen, die Gene von Interesse zu manipulieren oder einfach beschriften Zellen mit Reporter Proteine angewendet werden können.

Introduction

Neurale Stammzellen (NSC) generieren Neuronen und Macroglial Zellen während der Entwicklung der Großhirnrinde. Am Anfang-Kortikogenese NSCs durchlaufen mehrere Runden der symmetrischen Zellteilung, und erweitern Sie den Stammvater Pool. Teilen Sie dann die NSCs asymmetrisch um Neuronen direkt oder indirekt über Zwischenprodukte1zu generieren. Nur bei wechseln Mitte – zu spät-Kortikogenese, Stammväter um Astrozyten und Oligodendrozyten2,3,4zu generieren. Die komplette Mechanismen, die Zell-Proliferation und Differenzierung sowie der Beitrag der Schicksal eingeschränkt Stammväter zur Generation der einzigartige Arten von Neuronen oder Macroglial Zellen steuern bleiben jedoch eine Angelegenheit der intensiven Debatte4,5,6. Das Potenzial der einzelnen kortikalen NSCs, Neuronen und Astrozyten, Oligodendrozyten generieren wurde ausgiebig studiert in Vitro und in Vivo mit einer Vielzahl von Techniken wie: live-imaging in einzellige Kulturen7,8,9,10,11,12,13; Live-imaging in hoher Dichte Kulturen Kulturen3,14,15; Live-imaging Slice Kulturen16,17,18; klonale Analyse mit viralen Vektor-vermittelte genetische Kennzeichnung in hoher Dichte Kulturen14,15,19,20,21; klonale Analyse in Vivo mit Retroviren22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; und klonale Analyse in Vivo mit transgenen Tieren34.

Jede dieser Techniken stellt vor- und Nachteile. Zum Beispiel ist in Vivo Linie Ablaufverfolgung anfällig für die ZUSAMMENGEFASSUNG und splitting Fehler3, führt zu widersprüchlichen Schlussfolgerungen über das Potenzial der einzelnen kortikalen Vorfahren. Darüber hinaus sowohl in Vitro und in Vivo Studien anhand der Kennzeichnung von Vorläuferzellen zu frühen Zeitpunkten und posterior Analyse der Zelle Linien kann durch das unerkannt Auftreten von Zelltod während Abstammung-Progression35beeinflusst werden. Daher darf ein geeignetes System, das Potenzial der einzelnen NSCs zu analysieren die Identifikation aller Zellen generiert sowie die entsprechenden Charakterisierung der Zelle Schicksale innerhalb der Linie. Kombination von primären Zellkulturen und live Imaging ermöglicht diese Einstellung. Mit einzelligen Kultur und Time-Lapse video-Mikroskopie, zeigten Tempel Et Al. den Schalter in der Abstammung der einzelnen Großhirnrinde Stammväter von Neurogenese, Gliogenesis11. Später benutzt sie das gleiche System um zu zeigen, dass verschiedene Arten von Neuronen aus einer einzigen kortikalen Stammvater12generiert werden. Dieses System stellt jedoch eine wichtige Einschränkung: nur 1 % der kortikalen Vorfahren isoliert am frühen Kortikogenese Klone von 4 oder mehr Nachkommen9generieren. Nach der Zugabe von FGF2 erhöht die Frequenz der Zellen, die Erzeugung von 4 oder mehr Zellen auf ca. 8-10 %9. Dennoch ist diese Zahl zu klein, man bedenkt, dass praktisch alle kortikalen Stammväter proliferative in diesem Stadium. Darüber hinaus können nicht die möglichen Auswirkungen der FGF2 auf Schicksal-Spezifikation36auszuschließen. Um diese Einschränkungen zu umgehen, verwendet wir High-Density-Zellkulturen, die unterstützen die Verbreitung beider ventrikuläre (Pax6-Ausdruck) und subventricular (Tbr2-Ausdruck) kortikale Stammväter15. Darüber hinaus hat die Echtzeit-Beobachtung dieser Kulturen gezeigt, dass einige Funktionen der NSC Abstammung Progression unter diesen Bedingungen, wie z. B. Art der Zellteilung, Verlängerung des Zellzyklus, Potenzial einzelner Zellen, Neuronen und Glia, unter anderem zu generieren3,15reproduziert werden. Vor kurzem haben wir auch dieses System verwendet, um zu zeigen, dass das Überleben der Zellen von unreifen Großhirnrinde Neuronen in Mäusen37CREB-Signalisierung beeinflusst werden. So glauben wir, dass Time-Lapse Video-Mikroskopie des primären murinen Großhirnrinde Zellen in hoher Dichte angebaut ist ein leistungsstarkes und zugänglichen Tool, zellulären und molekularen Mechanismen der Zellzyklus Progression, Zellteilung, Überleben der Zellen und Zellen Schicksal Spezifikation zu studieren. Letzteres kann erreicht werden mit transgenen Tieren, so dass die Identifizierung von spezifischen Zelle Schicksale auf Echtzeit38,39,40 oder die Verwendung von Post-imaging Immunocytochemistry3,38,41,42.

Hier bieten wir eine Schritt für Schritt Protokoll zur primären Hirnrinde Zellkultur Unterstützung der Verbreitung von NSCs und die nachfolgende Generation von Neuronen und Macroglial Zellen vorbereiten. Wir diskutieren auch die Verwendung von Retroviren vermittelte Transfektion, Genexpression einzelner Zellen zu manipulieren, die identifiziert und Ebene der Einzeller mit Time-Lapse video Mikroskopie nachverfolgt werden können. Dieses Protokoll kann zur primären Hirnrinde Zellen isoliert vom Anfang bis zum Ende des Kortikogenese bei Nagetieren zu studieren können, ein paar Anpassungen jedoch nach der Stufe14. NSCs, die isoliert von anderen Quellen können auch mit Time-Lapse video Mikroskopie 2D Kulturen studiert werden, aber das geeignete Kultivierung System festgelegt werden, durch den Vergleich der Zelle Verhalten in Vitro und in Vivo38,43.

Protocol

All experiments involving live animals described in this protocol are conducted according to the National and International laws and were approved by the local University Animal Care and Use Committee (CEUA/UFRN), under the license 009/2014. The following protocol is performed in a sterile environment. Familiarity with basic cell culture is expected. 1. Dorsolateral Telencephalon Microdissection Prepare the dissection medium (100 mL): 98.5 mL Hank's Balanced Salt Solution (HBSS…

Representative Results

Primary cultures of cerebral cortex cells isolated from embryos E14 contain both progenitor and neuronal cells. During the period of imaging, progenitors undergo several rounds of cell division, increasing the number of cells (Figure 5 and Video Figure 1). Retroviral-mediated transfection of a few progenitor cells facilitates the identification of cell clones (F…

Discussion

Echtzeit-Beobachtung der primären Hirnrinde Zellen ermöglicht die Analyse der Zellproliferation, Zellteilung, Zellzyklus Länge, Zelldifferenzierung und Zelle überleben3,14,15,37. Noch wichtiger ist, ermöglicht es das Studium der einzelligen Abstammungen, führt zur Identifizierung von den Zwischenphasen während der Progression von NSCs auf Neuronen3erlassen. Schlie…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt von CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) und FAPERN (Fundação de Amparo eine Pesquisa Do Rio Grande do Norte).

Materials

Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen Life Technologies 14175129
HEPES Sigma-Aldrich H3375-25G
Penicillin/streptomycin Gibco 15140122
Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) Gibco 12400-024
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10437028
Glucose Gibco A2494001
B27 Gibco 17504044
trypsin-EDTA (0.05%) Gibco 25300054
Paraformaldehyde Sigma 16005
Goat serum Sigma-Aldrich 69023
Triton X-100 VWR International Ltd. 306324N
Isoflurane Sigma 792632
anti-MAP2, mouse Sigma M4403
anti-GFP chicken Aves 0511FP12
DAPI Sigma D9542
Goat anti-mouse alexa 594 Invitrogen A11005
Goat anti-chicken alexa 488 Invitrogen A11039
ImageJ NIH
tTt ETH Zurich
Cell observer microscope Zeiss
Pasteur pipette
PBS
The Tracking Tool (tTt) software https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html download link
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Keywords: Live ImagingPrimary Cerebral Cortex Cells2D Culture SystemNeural Stem CellsNeuronsGlial CellsNeurodevelopmentCell LineageCell DivisionCell CycleCell GrowthEmbryonic BrainDorsolateral TelencephalonCell DissociationTrypsin-EDTAProliferation MediumPoly-D-lysine
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Landeira, B. S., Araújo, J. A. d. M., Schroeder, T., Müller, U., Costa, M. R. Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System. J. Vis. Exp. (126), e56063, doi:10.3791/56063 (2017).
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