La formazione immagine dal vivo è un potente strumento per studiare i comportamenti cellulari in tempo reale. Qui, descriviamo un protocollo per time-lapse video-microscopia delle cellule della corteccia cerebrale primario che consente un esame dettagliato delle fasi promulgata durante la progressione di lignaggio da cellule staminali neurali primarie a differenziato neuroni e cellule gliali.
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Articolo metodologico
Immagini di corteccia cerebrale primario celle utilizzando un sistema 2D cultura dal vivo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, cellule progenitrici sottoporsi a diversi cicli di divisioni cellulari simmetriche e asimmetriche per generare nuovi progenitori o neuroni postmitotic. Più tardi, alcuni progenitori passare ad un destino di gliogenic, aggiungendo alle popolazioni astrociti e oligodendrociti. Utilizzo di time-lapse video-microscopia di colture di cellule della corteccia cerebrale primario, è possibile studiare i meccanismi cellulari e molecolari che controllano la modalità di divisione cellulare e i parametri del ciclo cellulare delle cellule progenitrici. Allo stesso modo, il destino delle cellule postmitotic può essere esaminato utilizzando proteine reporter fluorescenti cellula-specifico o post-imaging immunocitochimica. Ancora più importante, tutte queste caratteristiche possono essere analizzate a livello di singola cellula, permettendo l'identificazione di progenitori impegnati per la generazione di tipi cellulari specifici. Manipolazione dell'espressione genica può essere eseguita anche mediante transfezione mediata virale, permettendo lo studio dei fenomeni di cella-autonomi e non autonomi delle cellule. Infine, l'utilizzo di proteine fluorescenti di fusione permette lo studio della distribuzione simmetrica e asimmetrica delle proteine selezionate durante la divisione e la correlazione con il destino di cellule figlie. Qui, descriviamo il metodo time-lapse video-microscopia per immagine cellule murine di corteccia cerebrale primaria per diversi giorni e analizzare la modalità di divisione cellulare, durata del ciclo cellulare e destino delle cellule appena generate. Inoltre descriviamo un metodo semplice per transfect cellule progenitrici, che possono essere applicate a manipolare i geni di interesse o semplicemente marcare le cellule con proteine reporter.
Introduzione
Cellule staminali neurali (NSC) generare neuroni e cellule macroglial durante lo sviluppo della corteccia cerebrale. Al primi-corticogenesis, NSC sottoporsi a diversi cicli di divisione cellulare simmetrica ed espandere il pool di cellule progenitrici. Quindi, NSC dividono asimmetricamente per generare neuroni direttamente o indirettamente attraverso mediatori1. Solo a metà - alla fine-corticogenesis, progenitori passare per generare gli astrociti e oligodendrociti2,3,4. Tuttavia, i completare i meccanismi che controllano la proliferazione delle cellul....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti che coinvolgono animali vivi descritti in questo protocollo sono condotti secondo le leggi nazionali e internazionali e sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università locale (CEUA/UFRN), con la licenza 009/2014. Il seguente protocollo viene eseguito in un ambiente sterile. È prevista familiarità con la coltura cellulare di base.
1. Microdissezione del telencefalo dorsolaterale
- Preparare il terreno di dissezione (100 mL): 98,5 mL di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS), 0,5 mL 5 M HEPES pH 7,4, 1 mL di penicillina/streptomicina (10.000 unità/mL e 10.000 μg/mL). ....
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Risultati
Le colture primarie di cellule della corteccia cerebrale isolate da embrioni al giorno E14 contengono sia cellule progenitrici che cellule neuronali. Durante il periodo di acquisizione delle immagini, le cellule progenitrici subiscono diversi cicli di divisione cellulare, aumentando il numero di cellule (Figura 5 e Video Figura 1).
La trasfezione mediata da retrovirus di poche cellu.......
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Discussione
Osservazione in tempo reale delle cellule della corteccia cerebrale primaria permette l'analisi di proliferazione delle cellule, la modalità di divisione cellulare, durata del ciclo cellulare, differenziazione cellulare e cella sopravvivenza3,14,15,37. Ancora più importante, consente lo studio dei lignaggi unicellulare, consentendo l'identificazione delle fasi intermedie promulgata durante la p.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento e Científico Tecnológico), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) e FAPERN (Fundação de Amparo un Pesquisa do Rio Grande do Norte).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) | Invitrogen Life Technologies | 14175129 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Penicillina/streptomicina | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 12400-024 | |
| Siero fetale per vitelli (FCS) | Gibco | 10437028 | |
| Glucosio | Gibco | A2494001 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| tripsina-EDTA (0,05%) | Gibco | 25300054 | |
| Paraformaldeide | Sigma | 16005 | |
| Siero di capra | Sigma-Aldrich | 69023 | |
| Triton X-100 | VWR International Ltd. | 306324N | |
| Isoflurano | Sigma | 792632 | |
| anti-MAP2, topo | Sigma | M4403 | |
| anti-GFP pollo | Aves | 0511FP12 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Capra anti-topo alexa 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Capra anti-pollo alexa 488 | Invitrogen | A11039 | |
| ImageJ | NIH | ||
| tTt | ETH Zurigo | ||
| Microscopio per osservatori cellulari | |||
| Pasteur | |||
Riferimenti
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54 (3), 3....
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Ristampe e permessi
