חיים הדמיה של קליפת המוח ראשי תאים באמצעות מערכת תרבות 2D
Summary
הדמיה חיה הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור התנהגויות הסלולר בזמן אמת. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור זמן לשגות וידאו-מיקרוסקופיה של קליפת המוח ראשי תאים המאפשרת בדיקה מקיפה של השלבים שחוקקו במהלך ההתקדמות שושלת היוחסין מתאי גזע עצביים העיקרי נוירונים הבדיל, עכשיו, דונלד.
Abstract
במהלך התפתחות קליפת המוח, ובתאים עוברים כמה סבבים של חלוקות תאים סימטרי, אסימטרית כדי ליצור אבות חדש או נוירונים postmitotic. מאוחר יותר, כמה אבות לעבור גורל gliogenic, הוספת אסטרוציט ו אוליגודנדרוציטים האוכלוסיות. באמצעות זמן לשגות וידאו-מיקרוסקופיה של תרביות תאים קליפת המוח הראשי, זה אפשרי ללמוד את המנגנונים תאית ומולקולרית שליטה המצב של חלוקת התא ועל מחזור התא בפרמטרים של ובתאים. באופן דומה, אפשר לבחון את גורלו של תאים postmitotic באמצעות חלבונים כתב פלואורסצנט תאים ספציפיים או פוסט-הדמיה immunocytochemistry. חשוב מכך, ניתן לנתח כל התכונות הללו ברמה תא בודד, המאפשר זיהוי אבות מחויבת הדור של סוגי תאים ספציפיים. ניתן לבצע מניפולציה של ביטוי גנים גם באמצעות תקנים ויראלי בתיווך, המאפשר חקר תופעות תא-אוטונומי, ללא-תא-אוטונומי. לבסוף, השימוש של חלבונים פלורסנט פיוז’ן מאפשר חקר סימטרי אסימטרי והפצה של חלבונים הנבחר במהלך החטיבה, המתאם עם גורל תאי הבת. כאן, אנו מתארים את שיטת מיקרוסקופיה-וידאו זמן לשגות תמונה תאים מאתר קליפת המוח הראשי עבור ועד מספר ימים ולנתח את המצב של חלוקת התא, אורך מחזור התא, גורלו של תאים החדש שנוצר. אנו גם מתארים שיטה פשוטה כדי transfect ובתאים, אשר יכול להיות מיושם כדי לתפעל את הגנים של עניין או פשוט לשים תווית תאים עם הכתב חלבונים.
Introduction
תאי גזע עצביים (המל ל) ליצור נוירונים ותאי macroglial במהלך התפתחות קליפת המוח. בשעה מוקדמת-corticogenesis, NSCs עוברים כמה סבבים של חלוקת התא סימטרי, להרחיב את המאגר קדמון. לאחר מכן, NSCs לחלק בצורה א-סימטרית כדי ליצור נוירונים במישרין או בעקיפין דרך ביניים1. רק באמצע – עד מאוחר-corticogenesis, אבות מעבר להפקת האסטרוציטים ו אוליגודנדרוציטים2,3,4. עם זאת, המנגנון מלאה לשלוט התפשטות תאים, בידול, כמו גם את התרומה של אבות מוגבלת גורל לדור של סוגים ייחודיים של נוירונים או תאים macroglial נשארים עניין של ויכוח אינטנסיבי-4,–5,–6. הפוטנציאל של הפרט NSCs בקליפת המוח לייצר נוירונים, האסטרוציטים ו אוליגודנדרוציטים כבר למדה בהרחבה במבחנה וב ויוו באמצעות מספר עצום של טכניקות כגון: לחיות הדמיה תא בודד תרבויות7,8,9,10,11,12,13; חיים הדמיה תרבויות בצפיפות גבוהה תרבויות3,14,15; חיים הדמיה פרוסה תרבויות16,17,18; ניתוח המשובטים באמצעות ויראלי בתיווך וקטור גנטי תיוג תרבויות בצפיפות גבוהה14,15,19,20,21; ניתוח המשובטים ויוו באמצעות הרטרווירוס22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; ניתוח המשובטים ויוו באמצעות בעלי חיים הטרנסגניים34.
כל אחת מהטכניקות הללו מציג יתרונות וחסרונות. למשל, אין ויוו שושלת היוחסין עקיבה חשופה מכלילה, פיצול שגיאות3, המוביל למסקנות סותרות לגבי הפוטנציאל של אבות קורטיקלית בודדים. יתר על כן, שני חוץ גופית בתוך ויוו מחקרים בהתבסס על תיוג של ובתאים בנקודות זמן מוקדמת, ניתוח האחורי של תא שושלות עלול להיות מושפע המופע להתגלות של מוות של תאים במהלך שושלת היוחסין-התקדמות35. לכן, מערכת מתאימה כדי לנתח את הפוטנציאל של NSCs יחיד לאפשר הזיהוי של כל התאים שנוצר, כמו גם אפיון תא הגורלות בתוך שושלת היוחסין המתאים. שילוב של תרבות התא העיקרי הדמיה חיה מספק הגדרה זו. באמצעות מיקרוסקופ וידאו זמן לשגות והתרבות של תא בודד, מקדש. et al. הראו את המתג בשושלת של קליפת המוח בודדים אבות מ נוירוג’נסיס gliogenesis11. מאוחר יותר, הם השתמשו באותה המערכת כדי להראות כי סוגים שונים של נוירונים נוצרות יחיד קדמון קורטיקלית12. עם זאת, מערכת זו מציג של הקונה חשוב: רק 1% של אבות בקליפת המוח מבודדים-corticogenesis מוקדם ליצור שיבוטים של רומא של 4 או יותר-9. לאחר התוספת של FGF2, מגדילה את התדירות של תאים ליצירת תאים 4 או יותר ל- 8-10%9. למרות זאת, מספר זה הוא קטן מדי בהתחשב כי כמעט כל אבות קורטיקלית proliferative בשלב זה. יתר על כן, השפעת פוטנציאל FGF2 על גורל-מפרט שלא ניתן לשלול36. כדי לעקוף את המגבלות האלה, השתמשנו תרביות תאים בצפיפות גבוהה התומכים ההתפשטות של שניהם חדרית (לבטא Pax6) ו subventricular (ביטוי Tbr2) אבות קורטיקלית15. יתר על כן, התצפית בזמן אמת של תרבויות אלה הראו כי מספר תכונות של המועצה לבטחון לאומי שושלת היוחסין התקדמות משוחזרות בתנאים אלה, כגון מצב של חלוקת התא, הארכה של מחזור התא, הפוטנציאל של תאים בודדים ליצירת נוירונים, עכשיו, דונלד, בין היתר3,15. לאחרונה, גם השתמשנו מערכת זו כדי להראות כי איתות CREB משפיע על ההישרדות תא של קליפת המוח ילדותי נוירונים בעכברים37. כך, אנו מאמינים כי מיקרוסקופיה-וידאו בצילום מואץ של קליפת מאתר ראשי תאים גדל בצפיפות גבוהה הוא כלי רב עוצמה ונגיש לחקור מנגנונים תאית ומולקולרית של מחזור התא התקדמות, מצב של חלוקת התא, התא הישרדות מפרט הגורל התא. האחרון יכול להתבצע באמצעות בעלי חיים מהונדס, המאפשר זיהוי תאים מסוים הגורלות בזמן אמת-38,–39,–40 או השימוש של פוסט-הדמיה immunocytochemistry3,38,41,42.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד להכנת ראשי קליפת תרבית תאים תומכים התפשטות NSCs הדור הבא של נוירונים ותאי macroglial. נדון גם את השימוש של retroviral בתיווך תרביות תאים לתמרן ביטוי גנים של תאים בודדים, אשר ניתן לזהות מעקב ברמה תא בודד באמצעות מיקרוסקופ וידאו זמן לשגות. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד קליפת המוח ראשי תאים מבודדים מההתחלה לסוף corticogenesis של מכרסמים, אך כמה התאמות העשויים להידרש, בהתאם שלב14. NSCs מבודד ממקורות אחרים שניתן גם ללמוד באמצעות מיקרוסקופ וידאו בצילום מואץ של תרבויות 2D, אבל במערכת culturing המתאימה צריך להיקבע על-ידי השוואת תא התנהגויות במבחנה , ויוו38,43.
Protocol
Representative Results
Discussion
תצפית בזמן אמת של קליפת המוח ראשי תאים מאפשרת הניתוח של התפשטות תאים, מצב של חלוקת התא, אורך מחזור התא, תאית התמיינות תאים הישרדות3,14,15,37. חשוב מכך, הוא מאפשר חקר שושלות מתא בודד, שמוביל הזיהוי של שלבי ביניים שחוקקו במהלך ה…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי CNPq (Conselho נאסיונאל דה Desenvolvimento אזור e Tecnológico), שכמיות (Coordenação דה Aperfeiçoamento דה Pessoal דה Nível מעולה), FAPERN (Fundação de אמפרו עושה Pesquisa ריו גרנדה דו נורטה).
Materials
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen Life Technologies | 14175129 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 12400-024 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437028 | |
| Glucose | Gibco | A2494001 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 16005 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | 69023 | |
| Triton X-100 | VWR International Ltd. | 306324N | |
| Isoflurane | Sigma | 792632 | |
| anti-MAP2, mouse | Sigma | M4403 | |
| anti-GFP chicken | Aves | 0511FP12 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Goat anti-mouse alexa 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat anti-chicken alexa 488 | Invitrogen | A11039 | |
| ImageJ | NIH | ||
| tTt | ETH Zurich | ||
| Cell observer microscope | Zeiss | ||
| Pasteur pipette | |||
| PBS | |||
| The Tracking Tool (tTt) software | https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html | download link |
Riferimenti
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54 (3), 357-369 (2007).
- Costa, M. R., Bucholz, O., Schroeder, T., Götz, M. Late Origin of Glia-Restricted Progenitors in the Developing Mouse Cerebral Cortex. Cereb Cortex. 19 (Suppl 1), i135-i143 (2009).
- Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
- Costa, M. R., Müller, U. Specification of excitatory neurons in the developing cerebral cortex: progenitor diversity and environmental influences. Front Cell Neurosci. 8, 449 (2015).
- Schitine, C., Nogaroli, L., Costa, M. R., Hedin-Pereira, C. Astrocyte heterogeneity in the brain: from development to disease. Front Cell Neurosci. 9, 76 (2015).
- Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340 (6233), 471-473 (1989).
- Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372 (6503), 263-266 (1994).
- Qian, X., Davis, A. A., Goderie, S. K., Temple, S. FGF2 concentration regulates the generation of neurons and glia from multipotent cortical stem cells. Neuron. 18 (1), 81-93 (1997).
- Qian, X., Goderie, S. K., Shen, Q., Stern, J. H., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125 (16), 3143-3152 (1998).
- Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28 (1), 69-80 (2000).
- Shen, Q., et al. The timing of cortical neurogenesis is encoded within lineages of individual progenitor cells. Nat Neurosci. 9 (6), 743-751 (2006).
- Ravin, R., et al. Potency and fate specification in CNS stem cell populations in vitro. Cell Stem Cell. 3 (6), 670-680 (2008).
- Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Götz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
- Costa, M. R., Wen, G., Lepier, A., Schroeder, T., Götz, M. Par-complex proteins promote proliferative progenitor divisions in the developing mouse cerebral cortex. Development. 135 (1), 11-22 (2008).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Kriegstein, A. R. Distinct behaviors of neural stem and progenitor cells underlie cortical neurogenesis. J Comp Neurol. 508 (1), 28-44 (2008).
- Bultje, R. S., Castaneda-Castellanos, D. R., Jan, L. Y., Jan, Y. N., Kriegstein, A. R., Shi, S. H. Mammalian Par3 regulates progenitor cell asymmetric division via notch signaling in the developing neocortex. Neuron. 63 (2), 189-202 (2009).
- Williams, B. P., Read, J., Price, J. The generation of neurons and oligodendrocytes from a common precursor cell. Neuron. 7 (4), 685-693 (1991).
- Williams, B. P., Read, J., Price, J. Evidence for multiple precursor cell types in the embryonic rat cerebral cortex. Neuron. 14 (6), 1181-1188 (1995).
- Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nat Neurosci. 5 (4), 308-315 (2002).
- Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a recombinant retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
- Luskin, M. B., Parnavelas, J. G., Barfield, J. A. Neurons, astrocytes, and oligodendrocytes of the rat cerebral cortex originate from separate progenitor cells: an ultrastructural analysis of clonally related cells. J Neurosci. 13 (4), 1730-1750 (1993).
- Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104 (3), 473-482 (1988).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Clonally related cortical cells show several migration patterns. Science. 241 (4871), 1342-1345 (1988).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-440 (1992).
- Parnavelas, J. G., Barfield, J. A., Franke, E., Luskin, M. B. Separate progenitor cells give rise to pyramidal and nonpyramidal neurons in the rat telencephalon. Cereb Cortex. 1 (6), 463-468 (1991).
- Grove, E. A., Williams, B. P., Li, D. Q., Hajihosseini, M., Friedrich, A., Price, J. Multiple restricted lineages in the embryonic rat cerebral cortex. Development. 117 (2), 553-561 (1993).
- Mione, M. C., Danevic, C., Boardman, P., Harris, B., Parnavelas, J. G. Lineage analysis reveals neurotransmitter (GABA or glutamate) but not calcium-binding protein homogeneity in clonally related cortical neurons. J Neurosci. 14 (1), 107-123 (1994).
- Mione, M. C., Cavanagh, J. F., Harris, B., Parnavelas, J. G. Cell fate specification and symmetrical/asymmetrical divisions in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 17 (6), 2018-2029 (1997).
- Reid, C. B., Liang, I., Walsh, C. Systematic widespread clonal organization in cerebral cortex. Neuron. 15 (2), 299-310 (1995).
- McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic neural progenitors appear to be restricted to regional and glial fates before the onset of neurogenesis. J Neurosci. 21 (17), 6772-6781 (2001).
- Reid, C. B., Walsh, C. A. Evidence of common progenitors and patterns of dispersion in rat striatum and cerebral cortex. J Neurosci. 22 (10), 4002-4014 (2002).
- Gao, P., et al. Deterministic progenitor behavior and unitary production of neurons in the neocortex. Cell. 159 (4), 775-788 (2014).
- Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453 (7193), 345-351 (2008).
- Morrow, T., Song, M. R., Ghosh, A. Sequential specification of neurons and glia by developmentally regulated extracellular factors. Development. 128 (18), 3585-3594 (2001).
- Landeira, B. S., et al. Activity-Independent Effects of CREB on Neuronal Survival and Differentiation during Mouse Cerebral Cortex Development. Cereb Cortex. , 1-11 (2016).
- Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138 (6), 1057-1068 (2011).
- Pilaz, L. J., et al. Prolonged Mitosis of Neural Progenitors Alters Cell Fate in the Developing Brain. Neuron. 89 (1), 83-99 (2016).
- Hoppe, P. S., et al. Early myeloid lineage choice is not initiated by random PU.1 to GATA1 protein ratios. Nature. 535 (7611), 299-302 (2016).
- Gomes, F. L., et al. Reconstruction of rat retinal progenitor cell lineages in vitro reveals a surprising degree of stochasticity in cell fate decisions. Development. 138 (2), 227-235 (2011).
- Ortega, F., Berninger, B., Costa, M. R. Primary culture and live imaging of adult neural stem cells and their progeny. Methods Mol Biol. 1052, 1-11 (2013).
- Ponti, G., Obernier, K., Guinto, C., Jose, L., Bonfanti, L., Alvarez-Buylla, A. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (11), E1045-E1054 (2013).
- Jagasia, R., et al. GABA-cAMP response element-binding protein signaling regulates maturation and survival of newly generated neurons in the adult hippocampus. J Neurosci. 29 (25), 7966-7977 (2009).
- Costa, M. R., Jagasia, R., Berninger, B., Doering, L. C. Directed Neuronal Differentiation of Embryonic and Adult-Derived Neurosphere Cells. Protocols for Neural Cell Culture. , 29-49 (2009).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6 (12), 1847-1859 (2011).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15 (9), 6046-6057 (1995).
