Summary
우리는 우리가 대상으로 인플루엔자 A 바이러스의 바이러스 성 조류 인간 또는 murine 단일 클론 항 체의 바인딩을에 필요한 중요 한 잔류물을 식별 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜은 다른 바이러스 표면 glycoproteins 그리고 그들의 해당 중화 항 체에 적용할 수 있습니다.
Abstract
인플루엔자 바이러스는 호스트 면역 반응을 회피 하 고 적응 하는 놀라운 능력을 전시 한다. 한 가지 방법은 바이러스의 표면 glycoproteins에서 발생 하는 항 원 변화를 통해 이다. 탈출 이체의 세대에 elucidating 바이러스 면역 검출을 탈출 하는 방법을 식별 하는 항 체 바인딩에 필요한 중요 한 잔류물에 강력한 방법입니다. 여기, 우리 인플루엔자 A 바이러스도 변종 바이러스 성 조류 (HA)에 대 한 감독 또는 murine 단일 클론 항 체 (mAbs)를 이용 하 여 생성 하는 방법에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 기술 사용 하 여 우리는 이전 중요 한 잔류물 머리 나는 새로운 조류 H7N9 하의 줄기를 대상으로 항 체 바인딩을 위한 필요한 특징. 프로토콜은 다른 바이러스 시스템에 쉽게 적용할 수 있습니다. 탈출 이체의 분석은 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp) 저항 및 바이러스, 부여 결정 항 원 편 류를 모델링 및 백신 치료제의 설계에 중요 합니다.
Introduction
다른 RNA 바이러스와 마찬가지로, 인플루엔자 A 바이러스는 다양 한 항 원 이체 복제1,2,3의 각 라운드의 생성을 허용 하는 오류 중 합 효소를 소유한 다. 인플루엔자 바이러스는 항 체 바인딩의 손실에 지도 하는 표면 glycoproteins에 돌연변이의 축적을 통해 달성 된다 항 원 편 류를 통해 인간의 면역 반응을 회피 하 고 적응 하는 놀라운 능력. 바이러스 성 표면 glycoproteins, 하 및 응집 (NA)의 항 원 편 류를 다르게 매년 백신을 관리 하 고 필요를 필요로 합니다.
격리 및 항 원 특정 항 체의 생성 기술 발전 백신 유도 mAbs4,5,6,,78의 높은 수를 얻지 못했다. 차례로, 인플루엔자 A 바이러스를 광범위 하 게 중화 mAbs의 epitopes의 특성은 크게 주 었 여러 범용 인플루엔자 백신 후보자9,,1011의 개발 12,,1314. mAb의 항 원 발자국 elucidating 중립화의 구조적 결정 요인 밝혀 고 백신 디자인으로 정보 접근에 대 한 수 있습니다. 그러나, 그것은 현실도 구조적으로 바이러스 성 항 원15, 에 epitopes를 지도 하기 위하여 엑스레이 결정학 또는 cryo 전자 현미경 검사 법을 통해 mAbs의 광범위 한 패널 특성 실험실에 대 한 비용 효율적인 16 , 17 , 18.
엑스레이 결정학 또는 cryo 전자 현미경 검사 법 고가의 장비, 전문된 기술 및 잠재적으로 광범위 한 양의 데이터를 생성 하는 시간이 필요 합니다. 대체 하 고 빠른 접근 활용 오류가 RNA 의존을 통해 다양 한 바이러스 인구의 급속 한 세대 mAbs19,20의 epitopes를 결정 하기 위해 탈출 돌연변이 생성에 RNA 중 합 효소 21,,2223. 이스케이프 변종의 생성 어떤 특별 한 장비 또는 기술을 요구 하지 않는다 고 기존의 실험실 시 약 및 장비와 함께 수행할 수 있습니다.
여기, 인플루엔자 HA를 인식 하는 mAb 바인딩에 필요한 중요 한 잔류물의 매핑 허용 하는 방법을 설명 합니다.
Protocol
주의: 인간의 인구 (예를 들어, H1, H3)에서 순환 하는 인플루엔자 바이러스의 수는 biosafety 수준 2 클래스 병원 진료와 적절 한 개인 보호 장비 처리 해야 합니다. 바이러스의 처리 기관 검토 위원회에 의해 승인을 받아야 한다. 다음 프로토콜 시내산에서 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다.
참고: 바이러스 성 복제를 억제 하 특정 항 체는 i) 바인딩 또는 구형 머리 위에 수용 체 바인딩 사이트의 인접 한 사람과 말 초 수용 체 바인딩의 바인딩 ii) 것 들으로 일반적으로 분류 될 수 있다 도메인, 구형 머리의 측면 사이드와은 하의 줄기 지역 포함. 항 체 수용 체 바인딩 사이트 대상 대상 세포의 표면에 sialic acid 모티프의 교전을 방지 하 고 hemagglutination 억제 (HI) 분석 결과 사용 하 여 측정 될 수 있다. 이 음수가 되는 항 체 줄기 특정 항 체와 같은 아직도 바이러스의 복제를 억제할 수 있는 하지만 중화 분석 실험을 사용 하 여 평가 될 수 있다.
1. 항 체 안녕 및 중화 활동에 따라 분류
- 안녕 분석 결과
- 96 잘 V-하단 플레이트에 열 2 12에 1 x PBS의 25 µ L 추가.
- 희석 mAb 7B2 (머리 전용), 6F12 (스토킹 관련) 23와 100 µ g/ml PBS와의 열 1에 희석된 항 체 준비 aliquot 50 µ L x 1에 isotype 컨트롤. 또한 아무 mAb 컨트롤 1 x PBS ( 그림 1A)의 50 µ L을 추가 하 여 포함.
- 열 2, 열 1에서에서 25 µ L를 전송 하 여 항 체의 2-fold 직렬 희석을 수행 하 고 등등. 삭제는 마지막 25 µ L에서 열 12 ( 그림 1A).
참고: 확인 하십시오 항 체 통제의 행을 포함 해야 합니다. - 8 hemagglutination 단위/25 µ L 희석 바이러스 재고 바이러스 주식 (reassortant 바이러스는 HA와 NA의 A/캘리포니아/04/09 내부 세그먼트 A/Puerto 토 리코/8/34의 표현)을 희석. 각 음 (행 A g)를 희석된 바이러스 주식 (8 hemagglutination)의 25 µ L을 추가.
참고: 항 체와 바이러스 혼합 50 µ g/mL의 시작 최종 농도 50 µ L의 최종 볼륨 있어야 합니다. - 품 45 분에 대 한 상 온 (RT) 접시
- 다시 적정 행 (H), 추가 1 x PBS의 50 µ L 우물 H2에 H12. H1 잘 8 hemagglutination 단위/25 µ L의 100 µ L를 추가 합니다. 직렬로 h 1에서 h 2를, 50 µ L를 전송 하 여 2 배 희석 하 고 등등. 잘 H12에서 마지막 50 µ L를 삭제 합니다. 마지막으로, 96-잘 V-바닥판의 모든 우물을 0.5% 닭 포 르 트 드 적혈구 (RBC)의 50 µ L을 추가.
참고: 분석 결과에서 mAb 샘플 100 µ L의 최종 볼륨 있어야: mAb (25 µ L), 바이러스 (25 µ L) 및 증권 (50 µ L). 없는 mAb 컨트롤의 마지막 볼륨 PBS x 1의 25 µ L, 바이러스의 25 µ L, RBC의 50 µ L를 포함 해야 합니다. - 품 1 h. 4 ° C에서 접시
- 는 시각적으로 활동에 대 한 번호판을 읽기. 경우에 특정 항 체에 대 한 긍정적인 판독, 2.1 탈출 변종 생성 단계로 진행 합니다. 항 체가 부정 인 경우에, 항 체는 세포 문화 분석 결과에서 활동을 중화 하는 경우 평가 하기 위해 1.2 단계로 아래 진행.
참고:이 활성 mAb의 긍정적인 판독 했을 때 96 잘 V-바닥판은 45 ° 각도로 눈물 드롭 양식 것 이다 잘 ( 그림 1B 7B2)의 센터에 어두운 빨간색 RBC 펠 릿으로 표시 됩니다. 부정적인 판독 ( 그림 1B 6F12 및 아무 mAb) 잘 어두운 빨간색 RBC 펠 릿을 형성 하지 것입니다. Isotype 컨트롤 것입니다 어두운 레드 로얄 펠 릿 형성 하지도 고 한다 모양 줄기 특정 항 체, 6F12 또는 아무 mAb 동일한 제어 샘플 ( 그림 1B) 23.
- Microneutralization 분석 결과
- 플레이트 Madin 다 비 개 신장 (MDCK) 셀 셀/잘 조직 문화에서에서 2 x 10 4의 밀도에서 96 잘 접시 취급 하 고 37 ° C, 5% CO 2 17 19 h에서 품 어 .
참고: 셀 허용 될 수 사용 하기 전에 4 h의 최소 우물의 바닥에. - 7 수행 하는 별도 96 잘 접시 인간의 mAb 4 D의 3 연속 희석 05 5, CR9114 17 또는 isotype IgG 제어, 200 µ g/mL의 최소한의 필수 매체 (MEM) X 1에 토실기 보충 시작 농도에 phenylalanyl chloromethyl 케 톤 (TPCK)-트립 (1 µ g/mL) 신 대우 ( 그림 2).
참고: 행 A (시작 200 µ g/mL의 농도) 희석된 항 체의 75 µ L를 포함 해야 합니다. 직렬 (3-fold) 행 A 행 B, 25 µ L를 전송 하 여 접시를 희석 하 고 등등. 행 A H 50 µ L의 최종 볼륨을 가져야 한다. 저기 팁 희석 전송 사이 변경할 필요가 없습니다. - 희석 바이러스 주식 (reassortant 바이러스는 HA와 NA의 A/상하이/1/13 내부 세그먼트의 A/Puerto 토 리코/8/34) 50% 조직 문화 감염 복용량 (TCID 50)의 100 / 1 x에서 50 µ L MEM TPCK 처리 보완 트립 신 (1 µ g/mL) 24. 50 µ L/잘 희석된 바이러스의 항 체 준비 (단계 1.2.2)에 추가 합니다. 감염 되지 않은 세포 제어 웰 스에 1 X MEM의 50 µ L을 추가.
- 1 헤에 대 한 (와 함께 5% CO 2) 37 ° C 배양 기에서 바이러스 항 체 혼합물을 품 어
참고: 바이러스 항 체 혼합물 100 µ L의 총 볼륨 있어야 한다: 항 체 희석 (1.1.2 단계)의 50 µ L 및 100 TCID 50 (1.2.3 단계)를 포함 하는 바이러스의 50 µ L. - 우물에서 미디어를 발음 하 고 추가 바이러스 항 체 혼합물의 전체 100 µ L 해당 우물.
참고: 포부 이루어집니다 진공 흡 인기 8 채널 어댑터를 사용 하 여 연결할. 또는 수동으로 발음 하는 8 또는 12 잘 멀티 채널 마이크로-피 펫을 사용할 수 있습니다. Inoculum 제거 하거나 세척 하는 동안 모든 소망이 이루어집니다 항 체의 높은 농도에서 낮은, 변경할 필요가 팁 없이. - 1 x PBS의 200 µ L로 단층 세척. 1 x PBS (1.2.5 단계)에서 200 µ L 발음 2 세척의 총에 대 한 세척을 한 번 더 반복.
- 감염 단층 및 감염/1 헤 (와 함께 5% CO 2) 37 ° C에서 품 어 (1.2.4 단계)에서 바이러스 항 체 혼합물의 전체 100 µ L/우물을 추가 하 여 MDCK 세포의 단층
- 별도 96 잘 접시에 감염 시 항 체 희석의 또 다른 세트를 준비. 150 µ L 추가 행에서 각 항 체의 100 µ g/mL 및 1 x 100 µ L의 MEM 보충 TPCK 치료 (1 µ g/mL) trypsin H. 수행을 행 b에서 3 희석 행 b 행 A에서에서 50 µ L를 전송 하 여 행 H. 삭제 행 헤에서 마지막 50 µ L까지 등등, 각각에 대 한 전체 볼륨은 잘 100 같아야 µ L. 설정 제쳐두고.
참고: 항 체는 1 x MEM TPCK 취급 트립 신 (1 µ g/mL)와 보완에 희석. - 단계 1.2.7에서에서 단층에서 바이러스 항 체 inoculum을 발음 하 고 적절 한 항 체 희석 단계 1.2.8에서에서 준비의 전체 100 µ L/우물과 보충.
참고: 잘 포함 하는 경우 감염 (1.2.7 단계) 다음 보충 미디어 중 100 µ g/mL의 최종 항 체 농도 또한 100 µ g/mL (단계 1.2.8)의 최종 항 체 농도 포함 해야 합니다. - (와 함께 5% CO 2) 37 ° C 배양 기에서 24 h에 대 한 품.
- 96 잘 접시에서 미디어를 발음 하 고 세 번 1 x PBS의 200 µ L/잘 씻어.
- 1 h-20에 대 한 차가운 80% 아세톤의 100 µ L로 셀 수정 ° c.
참고: 80% 아세톤 솔루션은 두 배 증류수 (dd) H 2 O (예를 들어, 100% 아세톤의 80 mL 플러스 ddH 2 0의 20 mL)에 희석. 80% 아세톤 솔루션 사용 하기 전에 얼음에 냉장 될 수 있다. - 1 X PBS의 200 µ L/잘 셀 세 번 씻어.
- 블록 5% 우유의 200 µ L/잘 플레이트 1 X PBS에 희석 1 헤에 대 한 실시간에 번호판을 품 어
- Biotinylated 항 인플루엔자 nucleoprotein (NP) 기본 항 체의 추가 100 µ L 희석 1:2,000 PBS/1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) x 1에서 고 1 헤에 대 한 실시간에 번호판을 품 어
참고: 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스 전용 안티-NP 항 체를 사용 해야 합니다. - 1 x PBS 가진 접시 세 번 씻어.
- 추가 100 µ L streptavidin-말 무 과산화 효소 (HRP) 어원이 항 체의 희석 1:3,000 PBS/1% BSA x 1에서 고 1 헤에 대 한 실시간에 번호판을 품 어
- 플레이트 1 x PBS의 200 µ L로 세 번 세척.
- 100 µ L/잘에서 HRP 기질 시 약을 추가 하 고 실시간에 어둠 속에서 품 어
참고: 보육 시간 산 성 정지 버퍼 (아래)의 추가 하기 전에 최적화 되어야 합니다. 일반적으로, 15 ~ 30 분은 충분 한. - 담금질 5 M HCl의 50 µ L/잘 반응.
주의: 5 M HCl은 눈, 피부 및 점 막에 손상을 일으킬 수 있는 높은 부식성 시 약. 이 시 약의 추가 적절 한 개인 보호 장비와 배기 후드 아래 이루어져야 합니다. - 492에 번호판을 읽기 nm 배경 (감염 되지 않은 세포) 웰 스를 뺍니다.
- 계산 다음 수식 사용 하 여 비율 억제:
- 경우 항 체 중화 활동 (그리고이 활동이), 2.2 단계로 진행.
참고: 항 체 중화 활동 생체 외에서 부족이 활동 부족 합니다.
- 플레이트 Madin 다 비 개 신장 (MDCK) 셀 셀/잘 조직 문화에서에서 2 x 10 4의 밀도에서 96 잘 접시 취급 하 고 37 ° C, 5% CO 2 17 19 h에서 품 어 .
2. 세대 탈출 돌연변이 변종의
참고: 안녕 활동 부족 또는 중화 항 체는 더 아래에 설명 된 특정 프로토콜 분석.
- 프로토콜 1: 안녕-긍정/중화-긍정적인 항 체 ( 그림 3A )
- 10의 바이러스 주식 준비에 1 x PBS에서 단위/밀리 리터 (PFU/mL)를 형성 하는 6 패 400 µ L 볼륨.
- 4 희석 농도 증가의 항 체의 준비 (예를 들어, 0, 0.5, 0.05 및 0.005 mg/mL) 희석 당 100 µ L의 볼륨에서 1 x PBS에.
참고: 병렬에서 및 항 체의 부재에서 야생 형 바이러스 항상 passaged 한다. 이러한 passaged 바이러스의 시퀀스 문화 조건 세포에 돌연변이 탈출 적응 사이 구별에 도움이 될 것입니다. - 믹스 100 µ L 10의 6 각 항 체 희석의 100 µ L 또는 1 x PBS의 100 µ L 바이러스의 PFU/mL.
- 품 (와 함께 5% CO 2) 37 ° C 배양 기에서 1 시간 짧게 소용돌이입니다. 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) embryonated 계란 각 혼합물의 200 µ L 주입.
- 40-44 헤 (CO 2) 없이 37 ° C에서 알을 품 어
- 6 헤 최소 4 ° C에서 배양 하 여 바이러스 감염 embryonated 계란을 희생
- 수확 allantoic 액체 계란에서 앞에서 설명한 24 , 25.
- 24 , 26 위에서 설명한 대로 hemagglutination 분석 결과 수행 합니다. Allantoic 액체 준비 hemagglutination titers 없다면, 항 체 희석 0.00005 mg/mL까지 0.005 mg/mL에서 2 단계에서 반복.
참고:이 긍정적인 항 체의 saturating 농도 현재 모든 바이러스 입자를 무력화 수 있습니다. 따라서, 그것은 뿌리고에 존재 하는 항 체의 양을 감소 해야 할 수 있습니다. - 확인에서 수행 하 여 탈출 변형 시험 24 (단계 1.1).
참고:이 활성 항 체 차단 대상 셀에 sialic acid 모티프의 HA 약혼. 따라서, 그것의 동족 항 체의 존재 바이러스 능력 agglutinate Rbc (로얄 펠 릿의 존재)을 잃는다. 이론적으로,이 활성 항 체의 탈출 변종 아직도 그것의 동족 항 체의 존재도 sialic acid 모티브를 바인딩할 수 있습니다 하 고 따라서 Rbc (로얄 펠 릿) agglutinate 수 있습니다. 관심의 항 체의이 여전히 감지, 반복 단계 2.1.2 항 체의 높은 시작 농도에서 프로토콜.
- 프로토콜 2: 안녕-부정/중화-긍정적인 항 체 ( 그림 3B )
참고: 안녕 부족 하는 항 체를 중화 하는 것에 대 한 탈출 이체를 생성 하려면 활동, 바이러스 항 체의 양을 증가 존재 passaged 해야 합니다.- 1 x 10 6의 밀도에서 6 잘 플레이트에 플레이트 MDCK 셀 셀/잘 및 최소 4 h (와 함께 5% CO 2) 37 ° C 배양 기에서 품 어.
- 10 바이러스 주식 희석 6 PFU/mL 또는 1에서 이전 통로에서 바이러스 TPCK 치료 (1 µ g/mL) trypsin 500 µ L 볼륨에와 MEM x.
- 1에서 항 체 (0.02 mg/mL 원래 통로 대 한 이상에 대 한 모든 구절 다음)의 단일 희석 준비 250 µ L 볼륨에 트립 신 TPCK 처리와 MEM x.
- 믹스 250 µ L 희석 항 체 (+ 항 체)의 250 µ L로 희석된 바이러스 또는 1의 250 µ L의 MEM (항 체 제어) x.
- 바이러스 항 체 혼합물 (와 함께 5% CO 2) 37 ° C 배양 기에서 30 분을 품 어.
- 파스퇴르 유리를 사용 하 여 미디어 플라스틱 및 1 X PBS의 1 mL로 세포의 단층을 씻어 aspirate.
- 우물에 혼합물의 500 µ L을 추가 하 고 1 헤에 대 한 (와 함께 5% CO 2) 37 ° C 배양 기에서 품 어
- 1 시간 후 1의 2 mL와 함께 우물 보충 MEM TPCK 취급 트립 신 (1 µ g/mL)와 x.
- 현미경에 cytopathic 효과 (CPE)의 표시를 위해 48 h 후 감염에서 세포를 확인 하거나 바이러스 성장 26 검색 hemagglutination 분석 결과 수행.
- 항 체와 보충 문화에서 총 CPE 경우 수확 여러 곳을 알아내는-튜브, 라벨에 상쾌한 통로 번호와 스토어-80 ° c.
- 저장 100 µ L 1 x 2 mL와 MDCKs의 신선한 단층 감염 상쾌한의 MEM TPCK trypsin 및 항 체와 보충. 모든 통로 대 한 항 체 제어 하지를 포함 하도록 하십시오.
참고: 증가 항 체의 농도 (또는 연구원의 판단에) 두 배로 다음 통로 (매 2 일). - 바이러스 성장 항 체의 0.6 mg/mL의 최종 농도와 여전히 가능한 때까지 각 연속적인 통행에 항 체의 농도 증가. 고정 각의 상쾌한의 여러 병 통로 및-80에서 저장 ° c.
참고: 아무 항 체 컨트롤 확인 하는 다른 하나의 통로에서 바이러스의 성장에서 결정적 이다. 아니 항 체 제어에 총 CPE 하지만 아무 CPE에 경우는 + 항 체 그룹,이 항 체의 농도가 너무 높았다 고 아무 탈출 변종 생성 된 나타냅니다. CPE 아무 항 체 제어에 총만 중간에서 CPE는 + 항 체 그룹,이 잠재적인 탈출 이체의 존재를 나타냅니다. 다음 구절에서 통로 볼륨 상쾌한의 200 µ L 증가 하 고 탈출 변종 생성의 가능성을 증가 하는 항 체의 농도 유지.
3. 플 라크 정화를 통해 변종 탈출의 절연
- 1 x 10 6의 밀도에서 6 잘 플레이트에 플레이트 MDCK 셀 셀/잘 및 최소 4 h (와 함께 5% CO 2) 37 ° C 배양 기에서 품 어.
- 1에서 항 체 희석 TPCK 처리 trypsin 해당 탈출 돌연변이 바이러스의 250 µ L 250 µ L의 믹스 볼륨에서 300 µ g/mL에서 시작 된 메모리 x. 바이러스 항 체의 부재에서 passaged 또한 플 라크 정화 해야 합니다.
- 셀에서 미디어를 발음, 1 x PBS로 세 번 세척 하 고 바이러스 항 체 혼합물 (3.2 단계)의 전체 500 µ L을 추가.
- 바위 앞뒤로 단층의 건조를 방지 하기 위해 모든 10 분 확인 하 고 (와 함께 5% CO 2) 37 ° C 배양 기에서 1 시간에 대 한 번호판을 품 어.
- 바이러스 항 체 혼합물을 발음 하 고 오버레이 agar 미디어 항 체 (300 µ g/mL, 3.2 단계)의 해당 금액을 포함 하는 우물을 보충.
- (와 함께 5% CO 2) 37 ° C 배양 기에서 40-44 h에 대 한 접시를 품 어.
- 패 따기를 촉진 하기 위해 파란색 또는 검은 색 표시와 함께 표시 플 라크를 동그라미.
- 각 선택 4 패 탈출 MDCK 세포 또는 항 체의 부재에 계란에 passaged 된 야생 형 바이러스로 돌연변이 바이러스 항 체 조합.
- 1 x PBS의 100 µ L에서 플 라크를 resuspend.
- 10 일 오래 된 SPF embryonated 계란 플 라크 정화 탈출 돌연변이 바이러스의 전체 100 µ L 주입.
- 40-44 h (없이 5% CO 2) 37 ° C 배양 기에서 알을 품 어.
- 바이러스 (단계 1.1)의 존재를 확인 하는 hemagglutination 분석 결과 수행.
4. 바이러스 성 RNA와 분석의 하 시퀀스의 추출
페 놀 및 guanidine isothiocyanate 모노 phasic 솔루션 탈출 돌연변이 바이러스 allantoic 액체의- 추출 바이러스 성 RNA 200 µ L.
주의: 페 놀은 기침, 호흡 곤란을 일으킬 하 고 알맞게 접촉에 의해 피부를 자극 수 있는 휘발성 액체 시 약. - 증폭 바이러스 성 RNA 역전사의 사용에서 HA 세그먼트 및 인플루엔자 A 하 유전자 특정 뇌관 세그먼트 27.
참고: 표 2에 설명 된 인플루엔자 B 바이러스에 대 한 보편적인 뇌관 증폭 두 하 (~ 1800 bp)와 나는 (~ 1500 bp) 28. - 1 %agarose 젤에 RT-PCR 제품을 해결 및 올바른 크기의 밴드를 잘라 (~ 1800 bp).
- 젤 추출 실리 카 멤브레인 기반 정화 절차를 사용 하 여 PCR 제품 및 시퀀싱는 cDNA를 발송.
- 아미노산 잔류물에 돌연변이 차별화 하 여 항 체 바인딩 putative 탈출 변종에 발견 하 고 셀 문화 적응 또는 면역학 선택 야생 형 바이러스 passaged 필요한 식별.
- 야생-타입을 포함 하는 PCR 제품을 복제 또는 변형 하는 pCAGGs 식 벡터 (노트 NheI)으로 탈출.
- 탈출 변종 HA 항 체의 바인딩을 두 옵션 중 하나 (또는 둘 다) 아래에 설명 된 평가 될 수 있다.
5. 항 체 바인딩 분석의 탈출 변종
- 면역 형광
- 플레이트 293T 세포 2 x 10 4의 밀도에서 96 잘 접시에 셀/잘 고 24 h에 대 한 (와 함께 5% CO 2) 37 ° C 배양 기에서 품 어.
- 0.10 µ g/잘 인코딩 탈출 돌연변이 HA pCAGGS 플라스 미드의 셀 transfect, 바이러스 passaged HA, 및 transfection 시 약의 사용과 (unpassaged) 야생-타입 하.
- (와 함께 5% CO 2) 37 ° C 배양 기에서 48 h에 대 한 96 잘 접시를 품 어.
- 수정 100 µ L의 실시간에서 15 분 동안 0.5 %paraformaldehyde
주의: Paraformaldehyde 기침, 호흡 곤란을 일으킬 하 고 알맞게 접촉에 의해 피부를 자극 수 있는 휘발성 액체 시 약 이다. 그것은 잠재적인 인간 발암 물질로 지정 되어 있다. 시 약의 추가 발명된 화학 후드에서 이루어져야 합니다. - PBS 1 3 x와 워시 번입니다. 실시간에서 1 h 1 x PBS에 5% 우유와 함께 블록
- 1 x PBS 세 번 씻어. 실시간에서 1 시간에 대 한 관심의 항 체의 5 µ g/mL와 함께 품 어
- 이차 항 체 (항 인간 또는 반대로 마우스 알 렉 사 488) 1:2,000 PBS/1% BSA 어둠 속에서 RT에 1 h x 1에서의 희석에의 100 µ L로 품.
- 1 x PBS 세 번 씻어. 긍정적 이거나 부정적인 얼룩이 지기를 위한 형광 현미경에서 세포 관찰.
- 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)
- 플레이트 293T 세포 2 x 10 5의 조밀도에 셀/6-잘 접시에 잘하고 24 h. (와 함께 5% CO 2) 37 ° C에서 품 어
- 인코딩 탈출 돌연변이 HA pCAGGS 플라스 미드로 0.50 µ g/잘 셀 transfect, 바이러스만 HA, 및 transfection 시 약의 사용과 야생-타입 하 passaged.
- (와 함께 5% CO 2) 37 ° C에서 48 h에 대 한 6 잘 플레이트를 품 어.
- 48 h 후 성장 매체를 발음 하 고 부드럽게 두 번을 1 x PBS로 세척 (는 단층은 방해 하지 않아야 함).
- FACS 버퍼 (PBS/2% 송아지 태아 혈 청 x 1)의 500 µ L transfected 293T 세포 수확.
참고: FACS 버퍼 미리 사용 하기 전에 4 º C에서 냉장 되어야 합니다. - 4 시 5 분에 대 한 300 x g에서 수확된 293T 세포를 원심 ° c.
- 는 FACS 버퍼를 발음 하 고 관심 (1 ~ 5 µ g/mL의 최종 농도) mAbs를 들어 FACS 버퍼의 200 µ L로 resuspend. 20 분에 대 한 RT에서 품 어
- 원심 FACS 버퍼의 4 ° C. 씻어 두 번 500 µ L에서 5 분에 대 한 300 x g에서 셀. 유리는 펠 렛을 방해 하지로 피 펫 파스퇴르와 함께 신중 하 게 발음.
- 는 FACS 버퍼를 포함 하는 알 렉 사 488 (1:1, 000의 최종 희석)에 활용 된 이차 항 체의 200 µ L 함께 resuspend. 20 분에 4 ° C에서 어둠 속에서 품 어
- FACS 버퍼의 4 ° C. 씻어 두 번 500 µ L에서 5 분 300 g에서 세포를 원심 및 워시 버퍼를 신중 하 게 발음.
- 는 FACS 버퍼의 500 µ L에서 resuspend 및 바인딩 또는 polyclonal mAbs의 평가 FACS에 의해 HA와 셀 세라 페.
참고: 실험에는 untransfected 샘플으로 서 아무 mAb/polyclonal 세라 컨트롤을 포함 하도록 하십시오.
Representative Results
우리가 이전 계절 인플루엔자 바이러스 백신, H7N9 예방 접종, 또는 순차적 DNA/재조합 HA 단백질 예방 접종4,5 에 의해 유도 된 인간과 murine mAbs에 탈출 변종 생성 하이 방법의 사용 6,7. 위에서 설명한 항 체가 고 microneutralization 분석 실험 사용 하 여 다음4,5을 계속 하는 특정 프로토콜의 우리에 게 먼저 특징 이었다. 항 체 07-5 D 03, 07-5F01, 07-5 G 01, 07-4B03, 07-4E02, 07-4 D 05 조류 H7N9 바이러스 (A/상하이/1/2013) (표 1)에 대 한 안녕 고 중화 활동을 발견 하 고 따라서 프로토콜 1 (2.1 단계) 이용 되었다. S6-B01 (표 1), 042-100809-2F04, 045-051310-2B06, 41-5E04 등이 활동 부족 중화와 mAbs에 대 한 프로토콜 2 (2.2 단계) 탈출 변종을 생성 하 사용 되었다. 탈출 돌연변이 매핑 밝혀 항 체의 많은 바이러스 성 하4,5 (그림 4)에 다른 위치에서 중요 한 잔류물을 인식. 이 부정적인 항 체 줄기 지역4,5 탈출 점 돌연변이와 돌연변이 생성이 긍정적인 항 체의 대부분 있다 H7 하의 이전에 보고 된 항 원 사이트 근처 돌연변이 잔류물, 탈출 하는 동안 .
| 항 체 | 안녕하세요 활동 | NEUT 활동 |
| 07-5 D 03 | + | + |
| 07-5F01 | + | + |
| 07-5 G 01 | + | + |
| 07-4B03 | + | + |
| 07-4E02 | + | + |
| 07-4 D 05 | + | + |
| 41-5E04 | - | + |
| 045-051310-2B06 | - | + |
| 042-100809-2F04 | - | + |
| S6-B01 | - | + |
표 1: 항 체가 고 중화 활동의 테이블. 개인 실험 H7N9 백신 접종에서 고립 된 10 H7 전용 mAbs 전시 다른 시험관에 항 바이러스 활동5.
| 앞으로 뇌관 (5' 3') | 반전 뇌관 (5' 3') | Thermocylcer 조건 | ||||||||
| IAV | TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG | ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT | 60 분 42 º C, 20 94 º C의 2 분/5 사이클 94 º C s, 30 50 º C s 3 분 30 s 68 º C 20 94 º C의 40 주기 다음 s, 58 ° C 30에 대 한 s 그리고 10 분 동안 68 º C에서 최종 확장 시간 3 분 30 s 68 º C | |||||||
| IBV | GGGGGGAGCAGAAGCAGAGC | CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC | 60 분, 30 분 동안 55 ° C, 20 94 º C의 2 분/5 사이클 94 º C 45 º C s, 30 40 º C s 3 분 30 s 68 º C 20 94 º C의 40 주기 다음 s 58 º C 30에 대 한 s, 그리고 10 분 동안 68 º C에서 최종 확장 시간 3 분 30 s 68 º C | |||||||
표 2: 범용 인플루엔자 바이러스 뇌관. 인플루엔자 A27 B28 바이러스 및 그들의 각각 thermocycler 조건 하 세그먼트의 확대를 위한 뇌관 쌍.
그림 1: 안녕 분석 결과. 두 개의 마우스 H1 특정 mAbs 7B2 (머리 전용) 및 6F12 (스토킹 관련) 96-잘 V-하단 플레이트, 그리고 (B)는이 분석 결과23의 결과의 예를 사용 하 여 작업을 테스트 하는 분석 결과 설정에 대 한 도식 (A) A 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Microneutralization 분석 결과. Microneutralization 분석 결과 두 인간의 mAbs 4D 055 와 CR911417의 활동을 테스트 설정에 대 한 도식 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 탈출 돌연변이의 발생. 제안 하는 방법론은이 항 체에 의해 전시 microneutralization 활동에 종속 됩니다. (A)에 대 한 탈출 돌연변이 생성 중화이 긍정적인 항 체 필요할 수 있습니다. 계란, 단일 통로 (B) 항 체가 부정 중화 항 체 량 증가 함께 여러 구절을 포함 수 있습니다. 세포 조직 문화입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4:는 epitope 지도 새로운 조류 H7N9 하의 탈출 돌연변이 변형 생성의 예. 백신 유발 항 체 격리 후보와 개인에서 H7N9 인플루엔자 백신 탈출 돌연변이 변종을 생성 하는 데 사용 했다. 각 찌 꺼 기는 mAb의 효율적인 바인딩에 필요한 중요 한 아미노산의 위치 빨간 나타냅니다에 표시. 데이터는 Dunand 헨리 외., 20154에서 적응 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
대부분 탈출 돌연변이 통해 식별 된 잔류물의 정확 하 게 되어,이 방법의 주요 주의 사항 중 하나 이지만 탈출 이체의 점 돌연변이 의해 결정 되는 항 체의 분자 풋프린트 내에서 반드시 매핑되지 않을 수 있습니다. 구조 분석입니다. 이것은 원심 allosteric 효과 유사한 돌연변이 잔류물의 위치를 구조적 변화에 지도 하는 특정 잔류물에 돌연변이의 능력 때문 이다. 또 다른 한계는이 방법만 중화 항 체;에 대 한 구현 될 수 있습니다. 항 체를 체 외에서 선택적 압력 부족 돌연변이 탈출 이어질 것입니다. 그러나,이 제한 탈출 변종 이전 특징이 중화 항 체에 의해 생성 된 패널의 사용으로 극복할 수 있습니다. 황갈색 외. H7N9 바이러스를 중화 mAb의 탈출 변형 사용 비 중화 항 체7의 epitope를 지도.
그럼에도 불구 하 고, 탈출 이체의 세대를 통해 항 체의 epitopes를 elucidating 결정학 및 cryo 전자 현미경 검사 법, 둘 다 장비의 광범위 한 투자 요구에 대안을 제공 합니다. 다른 대안 mAbs 알라닌 스캔 또는 펩 티 드 스캔/자르기 돌연변이 사용 하 여 최소한의 바인딩 영역을 결정 하는. 알라닌 mutagenesis 스캔 이체의 많은 수를 생성 하는 펩 티 드 검색 하는 것은 선형 epitopes30으로 제한 하는 동안29, 심사 하는 동안에 작업의 상당한 금액을 요구할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 방법을 아무 특별 한 장비 또는 기술을 요구 하 고 사실, 사용 기존 생체 외에서 중화 분석 관심의 항 체의 탈출 이체를 생성 하도록 수정.
여러 구절 (예를 들어, 스토킹 특정 항 체)를 요구 하는 생성 탈출 변종에 대 한 프로토콜 높은 통로 0 항 체의 시작 농도에 따라 달라 집니다. 그것은 주의 측면에 잘못을 항 체의 절반 최대한 억제 농도 보다 낮은 반 로그에 로그 시작 강력한 바이러스 성장에 대 한 허용을 좋습니다. 연구원 면역 저압의 높은 titer 바이러스 문화 바이러스 인구에서 큰 유전 변이 가질 것 이라고 추측 수 있습니다. 도 이체 다음 구절에서 항 체 농도 점차적으로 증가 하 여 대 한 선택할 수 있습니다. 바이러스 성장 감소, 그 바이러스 상쾌한 양의 이전 구절에서 항 체 농도의 동일한 금액을 유지 하면서 다음 구절에서 늘릴 수 있습니다.
보편적인 인플루엔자 백신의 대부분의 목표는 HA의 스토킹 지역으로 강력한 항 체 응답을 이끌어내는 것 이다. 줄기-특정 항 체를 탈출 이체의 분석은 인플루엔자 바이러스 체력과 면역 압력 사이의 관계를 정의에서 중요 한. 흥미롭게도, 탈출 돌연변이 바이러스 스토킹 관련 mAbs에서 유래한 murine LD50 연구4에서 모든 감쇠 vivo에서 했다. 이러한 연구는 예방 접종 스토킹 기반 플랫폼에 대 한 강한 케이스를 제공합니다. 또한,이 프로토콜 작은 분자 억제제 같은 다른 안티 바이러스 화합물에 탈출 돌연변이 식별 하기 위해 사용 될 수 있습니다. 마지막으로,이 방법론 인플루엔자 바이러스 표면 glycoproteins에 국한 되지 않습니다 하지만 다른 바이러스 성 glycoproteins의 epitopes를 결정 하도 더 넓게 적용 될 수 있습니다.
Disclosures
저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 자금을 일부 알레르기 국립 연구소와 전염병에서 연방 자금, 건강의 국가 학회, 학과의 보건 및 인적 서비스, CEIRS 아래 계약 HHSN272201400008C (F.K.); NIH U19AI109946-01 (F.K.); 그리고 P01AI097092-04S1 (P.E.L.)입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon 96-well clear flat bottom TC-treated culture microplate with Lid | Corning, Inc. | 353072 | Assay plate use for the microneutralization assay |
| Falcon 96-well clear V-bottom plate | Corning, Inc. | 353263 | Assay plate use for the hemagglutination inhibition assay |
| 1X Minimal Essential Medium (MEM) | Gibco | 11095080 | Infection medium |
| Tosyl phenylalanyl chloromethyl (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Cleaves immature HA0 to HA1 and HA2 |
| Biotinylated anti-NP primary antibody (IAV) | EMD Millipore | MAB8258B | An antibody that recognizes the NP protein of influenza A viruses |
| Biotinylated anti-NP primary antibody (IBV) | EMD Millipore | MAB8260B-5 | An antibody that recognizes the NP protein of influenza B viruses |
| Streptavidin-HRP antibody | EMD Millipore | 18-152 | This is used as a secondary antibody for the biotinylated anti-NP antibody |
| HRP substrate (SIGMAFAST-OPD) | Sigma-Aldrich | P9187-5SET | o-phenylenediamine dihydrochloride water soluble substrate for HRP |
| 96-well V-bottom plate | Nunc | 249662 | Assay plate used for the hemagglutination assay |
| Chicken red blood cells | Lampire Biological Laboratories | 7201403 | Used to assess the ability of influenza virus to agglutinate |
| TRIzol | Ambion | 15596026 | Extraction of RNA |
| Superscript III | Invitrogen | 12574018 | Reverse transcriptase |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Isolation of amplified PCR product |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Transfection reagent |
| Anti-human IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11013 | Fluorescent secondary antibody for human antibodies |
| Anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Fluorescent secondary antibody for murine antibodies |
| 6-well polystyrene microplate | Corning, Inc. | 353934 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Nalgene long term storage Cryo-tubes | ThermoFisher Scientific | 5012-0020 | Freezing of viral culture supernatant |
| reassortant A/California/04/09 (H1) | Palese Laboratory | reassortant virus expressing the HA and NA of A/California/04/09 (H1N1) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) | |
| reassortant A/Shanghai/1/13 (H7) | Palese Laboratory | reassortant virus expressing the HA and NA of A/Shanghai/1/13 (H7N9) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) | |
| Bovine serum albumin solution (35%) | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| Qiagen gel extration kit | Qiagen | 28704 | Silica-membrane-based purification of DNA fragments |
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