Her præsenterer vi en trinvis protokol for spredningen af nanomaterialer i vandige medier med real-time karakterisering at identificere optimale sonikering betingelser, intensitet og varighed for forbedret stabilitet og ensartethed af nanopartikler dispersioner uden at påvirke prøve integritet.
Sonikering proces er almindeligt anvendt til de agglomerering og sprede nanomaterialer i vandige baseret medier, nødvendigt at forbedre homogeniteten og stabiliteten af suspensionen. I denne undersøgelse foretages en systematisk trinvis tilgang til at identificere optimale sonikering betingelser for at opnå en stabil dispersion. Denne fremgangsmåde er vedtaget og vist sig at være velegnet til flere nanomaterialer (cerium oxid, zinkoxid og kulstof-nanorør) spredt i ionbyttet (DI) vand. Dog med ændringer i enten nanomateriale type eller sprede medium skal der være optimering af de grundlæggende protokol ved at justere forskellige faktorer såsom sonikering tid, magt og sonikator type samt temperaturstigning i løbet af processen. Tilgangen registrerer dispersion processen i detaljer. Det er nødvendigt at identificere tidspunkter samt andre ovennævnte betingelser under sonikering proces, hvor der kan være uønskede ændringer, som skader partikel overflade dermed påvirke overfladeegenskaber. Vores mål er at tilbyde en harmoniseret tilgang, der kan kontrollere kvaliteten af den endelige, producerede dispersion. Sådan en retningslinje er medvirkende til at sikre spredning kvalitet repeterbarhed i nanoscience Fællesskabet, navnlig inden for projektgruppen for Nanotoksikologi.
Sonikering er processen til oprettelse af cavitations, som indebærer skabelse, vækst, og sammenbrud bobler (ofte kaldet hotspots) dannet i flydende på grund af bestråling af høj intensitet ultralyd1. I et laboratorium indstilling udføres ultralydbehandling metode ved hjælp af en sonikator. Der er forskellige sonicators, alt har den generelle funktion af de agglomerering partikler, som spredes i en lage som individuelle (eller primære) partikler. Ved at anvende sonikering, kan prøve homogenitet forbedre, potentielt at opnå et meget smallere partikelstørrelsesfordeling. Et vigtigt aspekt at overveje i forbindelse med spredning er stabiliteten i den endelige dispersion. Her, er stabiliteten af suspensionen defineret som hvor partiklerne ikke bosætte sig eller sediment ned i deres spredte tilstand og den gennemsnitlige hydrodynamiske diameter målinger ikke variere mere end 10% mellem de fem gentagne målinger taget i løbet af denne tid (omkring 10 min)2,3. Der er flere måder at måle spredningen stabilitet. Dette omfatter vurdering af zeta potentiale (ZP) gennem måling af elektroforese mobilitet af partikler. En anden er at måle den karakteristiske absorption af nanopartikler i UV spektrale vifte4.
I feltet i projektgruppen for Nanotoksikologi er evnen til at have kontrol over dispersion kvalitet meget vigtigt, som dispersion skridt vil bestemme vigtigste fysisk-kemiske egenskaber, såsom størrelse/partikelstørrelsesfordeling, form, sammenlægning/byområder, overflade opkræve, etc. denne igen vil i sidste ende påvirke interaktionen af partikler med test medier og resultatet af forskellige i in vitro og i vivo forsøg, for at udlede de potentielle risici ved nanomaterialer.
Sonikering udføres almindeligvis ved hjælp af en sonde-type (direkte) eller et ultralydsbad, eller ultralyd sonde med et hætteglas diskant (indirekte ultralydbehandling). Alle typer af sonikering er tilgængelige i en vifte af intensitet og output strømindstillinger, undertiden tilpasset med en anden type af sonotrode for bestemte processer eller krav, og egner sig til flydende enheder spænder fra 2 til 250 mL. Selv om sonden ultralydbehandling er kendt for at klare sig bedre end bad sonikering på grund af lokaliserede højintensive5, foretrækkes bad sonikering ofte frem for sonden-type for udarbejdelsen af toksikologiske test suspensioner på grund af muligt forurening risikoen gennem tip, erosion af titanium sonde tip efter længere tids brug, og sonden nedsænkning dybde uoverensstemmelser. En ultralyd sonde monteret med et hætteglas diskant er ligeledes fordelagtig over direkte sonden på grund af de ovennævnte kontamineringsrisici samt operation venlighed af udstyr. Flere hætteglas er sonicated på samme tid og med den samme intensitet. Dette ikke kun sparer tid men sikrer, at alle prøverne behandles ens, hvilket gør resultaterne blandt prøver mere pålidelige og sammenlignelige. Sikkerhedsforskning af nanomaterialer undgås forurening altid. Men sonden sonikator passer ikke dette krav og er ikke blevet testet. Sonden sonicators er kendt for at forårsage nogle uundgåelige bivirkninger såsom prøve forurening på grund af tip erosion samt reduceret energiproduktion fører til ændringer af dispersion betingelser, dermed at kompromittere data reproducerbarhed6, 7 , 8. Derudover prøver er normalt kører i udækkede beholdere til flydende tab på grund af fordampning samt støv deposition. For at undgå disse utilsigtede ændringer, anbefaler de seneste undersøgelser alternative indirekte sonicators baseret på deres effektive energi levering samt suspension renhed sikkerhed6.
Ikke-optimeret ultralydbehandling kan have en skadelig virkning på resultaterne. Potentielt kan det ændre de vigtigste fysiske og kemiske egenskaber af nanomaterialer som størrelse, størrelse distribution, morfologi og overflade afgift2,9. Tidligere litteratur har rapporteret sådanne mangler at kontrollere sonikering proces og indflydelse på partikel parametre som nano-TiO25,10,11, nano-ZnO6og nano-kobber12 . Desuden har tidligere undersøgelser vist at sonikering proces ikke kun ændrer partikel egenskaber men også regulerer resultatet af toksikologiske forsøg12,13.
For at have kontrol over dispersion proces, er det vigtigt at overvåge og forstå hvordan forskellige faktorer såsom sonikator type, instrument magt og varighed, diskenheder, etc., kan påvirke dispersion kvalitet. Derfor er der behov for at have en systematisk procedure til at analysere vigtigste fysisk-kemiske egenskaber af partikler i spredning på forskellige tidspunkter af sonikering proces. Selv om sådanne overvejelser har taget i betragtning ved et par forskere, er arbejde på dette område begrænset. Bihari et al. har undersøgt dispersion stabilitet af forskellige nanomateriale dispersioner lavet ved hjælp af forskellige ultralyd energier med forskellige spredning stabilisatorer14. En nylig gennemgang af Hartmannn et al. fremhævet at selvom arbejde er blevet gjort for at forstå de forskellige faktorer, der påvirker nanomateriale dispersion kvalitet f.eks., type af sonikator brugt, ultralydbehandling tid, osv., der er stadig ingen veldefineret og alment accepterede sonikering procedure understøtter der aktuelt nanotoxicological test og undersøgelser7,15.
Adskillige analytiske karakterisering teknikker bruges til at overvåge dispersion kvalitet. Disse omfatter anvendelse af: dynamisk lys spredning (DLS), Disc centrifugering, elektroforese lys spredning (ELS), Ultraviolet-synlige (UV-vis) spektroskopi og transmissions elektronmikroskopi (TEM), som måler størrelsen/partikelstørrelsesfordeling, zeta potentiale, dispersion stabilitet og morfologi karakteristika, henholdsvis. DLS bruges ofte til at bestemme den hydrodynamiske diameter (Z-gennemsnit) af partikler og polydispersity indeks (PdI) af nanomateriale dispersion. Ved multimodal størrelse uddeling af DLS, kan Z-gennemsnit ikke er enig med intensitet-vægtede størrelse distribution intensitet. Som sådan kan tilbydes transportforbrugerne middelværdien af intensitet-vægtede størrelse distribution. PdI afspejler rammedirektivs størrelse fordeling med en skala lige fra 0 – 1, med 0 er en monodispersed prøve og 1 er en meget polydisperse sample16. Disc centrifugering er en adskillelse teknik bruges til at bestemme partikelstørrelsesfordeling, ved hjælp af centrifugal bundfældning i flydende substrat. Partikler sediment inden for en optisk klar og roterende disk og mængden af lys spredt af partikler, når de når kanten af disken er optaget og omdannet til partikelstørrelsesfordeling, ved hjælp af Stokes’ lov. For at løse multimodale partikel distribution, er teknikker såsom disk centrifuge mere egnet, da de har en separation mekanisme element integreret i apparatet. Zeta potentielle (ζ –potentielle) af partikler er defineret som den elektriske potentiale på deres shear eller glide fly, som er en nominel grænse inden for den elektriske dobbelt lag, der adskiller (bulk) væsken viser normal tyktflydende adfærd fra de Stern lag, et lag, som overvejende er sammensat af counter ioner og anses for at flytte med partikel. Zeta potentiale er direkte relateret til den overflade afgift af partikler og derfor den elektrostatiske interaktion (dvs., frastødning/tiltrækning) mellem partiklerne. Denne parameter er derfor betragtes som en primær indikator for nanomateriale dispersion stabilitet. Af konventionen, zeta potentielle værdi under -25 mV og over 25 mV anses for stabil17,18. Koncentration og typen af ioner samt pH løsning påvirker kraftigt zeta potentielle19. ELS bruges til at måle partikler i dispersion elektroforese mobilitet og denne mobilitet er konverteret til zeta potentiale gennem Henry ligning og Smoluchowski eller Hückel modeller. UV-vis spektroskopi er en teknik, der anvendes til at kvantificere de lys, der er absorberet og spredt af en stikprøve på en bestemt bølgelængde. Det er ofte bruges til at overvåge dispersion stabilitet ved at måle den karakteristiske absorption af nanomaterialer i regionen UV. Endelig, TEM er ofte bruges til at visualisere og analysere størrelse, størrelse distribution, byområdet og form af nanopartikler5,14,15,20.
Vi præsenterer en sammenlignende undersøgelse af seks forskellige nanomateriale dispersioner lavet ved hjælp af ultralyd bad og en ultralyd sonde monteret med et hætteglas diskant. Partikel koncentration, temperatur, sonikator type og indstillinger, der bruges i undersøgelsen er angivet i protokollen, således at de eksperimentelle indstillinger for lignende sonder og ultralyd bade kan udledes. De følgende nanomaterialer bruges: sølv (Ag), cerium oxid (CeO2), zink oxid (ZnO, NM110-hydrophylic og NM111-hydrofobe) og kulstof-baserede nanomaterialer såsom kulstof-nanorør (A32 og A106, se Tabel af materialer).
Vurdering af dispersion kvalitet på forskellige tidspunkter langs sonikering proces er lavet ved hjælp af forskellige karakterisering teknikker, nemlig DLS for størrelse/partikelstørrelsesfordeling, Disc centrifugering i størrelse distribution, ELS for zeta potentiale, UV-vis spektroskopi for stabilitet og TEM for partikel form og homogenitet. En række forskellige nanomaterialer spænder fra metaloxider til kulstof-baserede vurderes. Til sammenligning bruges kommercielle vandig suspension af sølv nanopartikler (Ag NPs) stabiliseret med citrat udjævningen parallelt, for at udlede de forventede langsigtede stabilitet af en relevant kommercielt tilgængelige suspension. Naturligvis, denne Ag NPs model er ikke direkte relateret til nogen af procedurerne, spredning, men fungerer udelukkende for at angive behovet for at re sonikeres eller re-regulering suspensioner efter et stykke tid lagerplads ændringer såsom re byområdet er bundet til at opstå i opbevaring. Suspensionen opbevares i køleskabet i to måneder. I denne periode, er spredningen kendetegnet for at identificere potentielle bymæssigt område af partikler. De første resultater viser en ustabil suspension (som beskrevet i afsnittet resultater ). Efterfølgende underkastes denne dispersion yderligere forskellige sonikering behandlinger, svarer til de andre nanomaterialer anvendes i undersøgelsen. Formålet med undersøgelsen er at bekræfte, at vi de kan vedblive suspension gennem samme sonikering protokol. Ag NPs model kan således knyttes som benchmark for langsigtede undersøgelser der repræsenterer ny spredning af partikler i optimeret form.
Protokollerne dispersion præsenteres her del ligheder med dem, der offentliggøres i den tidligere litteratur og indeholder nogle af de få tidligere fremsat af tidligere arbejdstagere7,21,22,23 ,24,25. I denne undersøgelse er en systematisk og trinvis tilgang bruges til at overvåge dispersion kvalitet i hele dispersion protokol. Denne strategi forpligter sig til real-time karakterisering af nanomateriale dispersioner, for at identificere optimale eksperimentelle dispersion betingelser (figur 1).
Figur 1. Rutediagram skildrer den ordning og trinvis rækkefølgen af dispersion protokol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Det ultimative mål med studiet er at udvikle en strategi, der ville tillade identifikation af optimal sonikering betingelser at gøre dispersioner af en række udvalgte nanomaterialer i vand. Et forsøg er lavet her omhyggeligt dokumentere protokol trin og parametre under sonikering for at opfylde de huller tidligere identificerede i anmeldelser samt at følge henstillingerne i de sidste15. Optimal spredning betingelser identificeres ved at karakterisere dispersioner efter hver sonikering cyklus og prøve stabilitet og ensartethed. Vurdering af virkningerne af sonikering procedurer og stabilitet status er baseret på de karakteristiske ændringer i vigtigste fysisk-kemiske egenskaber af nanomaterialer, som bestemmes af forskellige analytiske teknikker: DLS, ELS, UV-vis, og TEM. Den nuværende protokol er en tilpasset metode for spredningen af nanomaterialer fra den seneste litteratur og andre forsknings projekter21,22,37,38,39 med nogle ændringer og forbedringer vedrørende de vigtigste huller, trin og deres anvendelighed til bredere nanomaterialer af lignende overflade profil7. Dog er forsigtig justeringer nødvendige med hensyn til deres sonikering tid, styrke og type for deres anvendelse til andre nanomaterialer. Også i er videre arbejde forpligtet til at etablere en sammenhæng mellem sonikering procedure og biologisk aktivitet af nanomaterialer. Seks forskellige typer af nanomateriale dispersioner der evalueres og sammenlignes, primært for deres stabilitet, ved hjælp af et ultralydsbad og en ultralyd sonde monteret med et hætteglas diskant på faste tidspunkter. For at opretholde suspensionen renhed og utilsigtede ændringer forårsaget på grund af forurening, undgås sonde sonikering her. I hætteglas diskant, kan af hætteglas forblive lukket. Dette eliminerer enhver krydskontaminering af prøver.
Kalibrering af sonicators er en afgørende faktor, da en række sonicators er tilgængelige med forskellige frekvenser, amplitude og beføjelser. Bestem den effektiv akustisk energi leveret til suspensionen ved udføres kalibrering af sonicators ved hjælp af kalorimetri. Den akustiske effekt leveret 70% amplitude indstilling for hætteglas diskant og for 100% ultralydbad indstilling er beregnet til at være < 1 W (0,75 ± 0,04 W og 0.093 ± 0,04 W, henholdsvis). Dog power output anført af producenterne for hætteglas diskant og bad sonikator er 200 W og 80 W, henholdsvis. Dette angiver, at trods den høje strømkilde det meste af energien går tabt under generation af cavitational bobler og kun en lille brøkdel faktisk leveres til dispersion under behandling26. Nylige undersøgelser har fremhævet betydningen af cavitational måling kontrol i forhold til den tilladte effektoptag for sonikator til en bedre spredning kontrol under sonikering8. Metoden, der synes lovende for kontrolleret spredningen af meget delikat nanomaterialer såsom CNTs og anbefales til fremtidige undersøgelser.
Hver teknik, der anvendes i undersøgelsen er baseret på forskellige principper med begrænsninger til alle. DLS er ikke en ideel teknik til ikke-sfæriske suspensioner samt stærkt polydisperse systemer. I sådanne forhold anbefales DCS på grund af høj opløsning, nøjagtighed og præcision40. DCS kan helt adskilte meget smalle størrelse distribution toppe, der afviger så lidt som 3%. TEM giver direkte visuelle billeder af nanopartikler og er et fantastisk værktøj til bestemmelse af sammenlægning, spredning, størrelse og form af partikler, men teknikken kræver prøven tørring, hvilket kan føre til artefakter41. Dette kan fjernes ved vask gitre med ultrarent vand som beskrevet i trin 4.5.3.
Blandt andre fremhæver metoden, der nogle kritiske trin som type i hætteglas bruges i protokollen, nedsænkning dybde og placeringen af hætteglassene i ultralydsbad samt hætteglas diskant. Temperaturkontrol af systemet under agitation er en vigtig parameter. Hyppige vandskift i ultralydsbad og pulserende mode køre for hætteglas diskant anbefales for at undgå enhver varmeudvikling under sonikering, således at man undgår enhver prøve ændringer. Trinnet tørstofmængden for hydrofobe prøver såsom zink oxid hjælper i spredningen af partikler, men dette kan fremkalde nogle uønskede ændringer. Sonikering tid og energi skal være høj nok til at de-vedblive partiklerne, men ikke for meget at det bryder partiklerne. Resultaterne viser, at klumpe brud er afhængige af partikel type.
Vores resultater fremhæve vigtigheden af at have en detaljeret dispersion protokol, som resultaterne viser, at vigtigste fysisk-kemiske egenskaber potentielt kan ændres undervejs sonikering som styret af faktorer såsom sonikator type, ultralydbehandling varighed tid, og power output. Resultater har vist, at stikprøven integritet potentielt er kompromitteret på højere intensitet agitation. Resultaterne viser, at CNTs er meget følsomme over for agitation, så går i stykker er meget sandsynligt, at forekomme, når sonikering varighed og styrke er ændret. Tæt på optimale indstillinger for spredningen af CNTs er mellem 2-15 min i den ultralydbad og kun 2 min. ved hjælp af en ultralydsonde. Men ultralydbehandling stadig kan have forårsaget nogle nanorør shortenings, der præcist ikke kan kvantificeres her. DLS kan ikke være en ideel teknik til karakterisering af CNTs, men det stadig kan give hydrodynamiske diameter for nanorør og disse data kan være informative forskelle i længden-distributioner CNTs blandt forskellige prøver16, 42,43. Tidligere undersøgelser viser, at CNTs dispersion-protokollen kan blive meget forstærket ved tilsætning af overfladeaktive stoffer som overfladeaktive molekyler er absorberet på nanorør éncellelag, hvilket giver en hindring for brud på grund af sonikering35, 44. men dette kan ikke sammenlignes direkte til denne protokol som ingen overfladeaktive stoffer, der er involveret i denne sag. Det er vigtigt at bemærke, at sikre længde størrelse distribution for CNTs er meget vigtigt, som størrelsesforholdet er ofte korreleret med visse toksikologiske svar. Derimod CeO2 gav forskellige resultater i forhold til CNTs, i hvilke langvarig sonikering gange benytter enten ultralydbad eller sonde, føre til dannelsen af primære partikler. Forskel i resultaterne mellem CNT og CeO2 tilfælde fremhæver vigtigheden at skræddersy dispersion protokoller f.eks., optimere sonikering tid og effekt i overensstemmelse med begyndende materiale dvs, type af nanomateriale pulvere. Hver nanomateriale pulver prøvetype er anderledes, da der vil være forskellige grad af bymæssigt område inden for pulveret, selv. I visse tilfælde har nedtrapning byområdet proces med held resulterede i nedtrapning byområdet primære partikler niveau, som fremgår af fremkomsten af andre formede partikler i TEM-billeder, som ikke var synlige før trinnet sonikering. Den langvarige sonikering resulterede i den løbende bryde cerium oxid vandbad på forskellige vinkler, hvilket fører til multi-facetteret partikler.
I tilfælde af kommercielt købte vandige prøve af Ag NPs dispersioner understrege vores resultater også behovet for langsigtet stabilitet og ensartethed vurdering. Der er behov for at sikre, at dispersioner er blevet tilstrækkeligt karakteriseret forudgående at bruge, især i tilfælde af langtidsopbevaring. Nanomaterialer har dog en meget kort holdbarhed. De ældes med tiden og kan opføre sig forskelligt efter lang sigt opbevaring i forhold til en frisklavet dispersion.
Resultaterne her fremhæve behovet for en harmoniseret strategi til at identificere en optimeret protokol for forskellige nanomaterialer. Den præsenterede foreslåede strategi er at gennemføre forskellige variationer i metoden ultralydbehandling og sikre at dispersioner på forskellige tidspunkter er tilstrækkeligt karakteriseret ved hjælp af supplerende analytiske metoder. Vægt på brugen af en multi metode tilgang til at karakterisere og overvåge dispersion kvalitet gennem tiden og forskellige forsøgsbetingelser er blevet fremhævet af tidligere arbejdstagere45. Selv om forskellige metoder til sonikering er blevet præsenteret for at tage højde for specifikke nanomateriale spredning i undersøgelsen, kan potentielt de bruges som grundlag til at sprede andre metal og oxid nanomaterialer (af lignende overflade egenskaber) i vand. Dog kræver at have nogen ændring i enten nanomateriale type eller flydende medium behovet for at optimere den grundlæggende protokol, som kan gøres ved omhyggelig justering af forskellige faktorer fxultralydbehandling tid, styrke og sonikator type. Uanset protokollen er valgt og udpeget som optimal, der er altid behov for at have en detaljeret rapport om ordningen og trinvis rækkefølgen af sonikering dispersion procedure. Det er vigtigt at forbedre interpretability og sammenlignelighed. En af anvendelserne af denne protokol er at lette data sammenlignelighed blandt andre labs, fører til en harmoniseret og standardiseret tilgang til fremtidige undersøgelser. De nuværende metode og kontrol parametre kan udnyttes til andre sprede medier bortset fra vand og sammenligninger kan tegnes på et sag til sag.
The authors have nothing to disclose.
Forskning fører til disse resultater har modtaget støtte fra NE/J010783/1. Projektet NanoValid har modtaget støtte fra EUs syvende Program for forskning, teknologisk udvikling og demonstration under grant aftale nr. 263147.
Cerium oxide nanopowder | Sigma-Aldrich | 544841 | <25 nm particle size (BET) |
Zinc oxide | European Commission's Joint Research Centre (JRC) | NM110 | hydrophylic |
Zinc oxide | European Commission's Joint Research Centre (JRC) | NM111 | hydrophobic |
Multi walled carbon nanotubes | NanoMile project (Large Collaborative Project under the European Commission's 7th Framework Programme) | A32 (MWCNT1) | 3.0±1.8 µm long, O/C ratio of 4.5% |
Multi walledcarbon nanotubes | NanoMile project | A106 (MWCNT2) | 3.3±2.4 µm long, O/C ratio of 7% |
Silver dispersion | Sigma-Aldrich | 730785 | 10 nm particle size (TEM), 0.02 mg/mL |
Zetasizer nano | Malvern Instruments | Particle size and zeta-potential measurements | |
Disc Centrifuge | CPS instruments Inc. | Model DC 24000 | Particle size distribution by centrifugal sedimentation |
Transmission electron microscope | JEOL USA | Jeol 1200EX TEM | Bright field images, particle size, shape, agglomeration |
Ultrasonic probe fitted with a vial tweeter | Hielscher | UIS250V | Sonicator |
Ultrasonic bath | Branson | Model 1510 | Sonicator |
Eppendorf vials | Eppendorf | 2236411-1 | 1.5ml capacity |
UV-vis spectrophotometer | Jenson flight deck | Model 6800 | SPR peaks, suspension stability |
Disposable folded capillary cell | Malvern Instruments | DTS 1070 | for the measurement of elecr |
Zeta- potential standard | Malvern Instruments | DTS 1235 | |
Quartz cuvette | Jasco | 1103-0042 | Rectangular quartz cell 10 x 100 Spectrosil Quartz with lid 190 -2700 nm |