Metodo ottimizzato di LC-MS/MS per l'analisi di High-throughput di campioni clinici di Ivacaftor, suoi principali metaboliti e Lumacaftor nei fluidi biologici di pazienti affetti da fibrosi cistica
Summary
Combinazione di ivacaftor e ivacaftor-lumacaftor sono due nuovi farmaci CF. Tuttavia, c’è ancora una carenza di comprensione sulle loro PK/PD e farmacologia. Presentiamo una tecnica ottimizzata di HPLC-MS per l’analisi simultanea di ivacaftor e suoi metaboliti principali e lumacaftor.
Abstract
Difetti nel regolatore di conduttanza del trans-membrana di fibrosi cistica (CFTR) sono la causa della fibrosi cistica (CF), una malattia con le manifestazioni polmonari mortali. Ivacaftor (IVA) e combinazione di ivacaftor-lumacaftor (LUMA) sono due nuovi farmaci svolta CF che modulano direttamente l’attività e il traffico della proteina CFTR difettosa. Tuttavia, c’è ancora una carenza di comprensione sui parametri di farmacocinetica/farmacodinamica e la farmacologia di ivacaftor e lumacaftor. La tecnica HPLC-MS per l’analisi simultanea delle concentrazioni di ivacaftor, idrossimetil-ivacaftor, ivacaftor-carbossilato e lumacaftor nei fluidi biologici in pazienti che ricevono la combinazione standard di ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor la terapia è stata precedentemente sviluppato dal nostro gruppo e parzialmente convalidata a norme FDA. Tuttavia, per consentire l’analisi di alto-rendimento di un numero maggiore di campioni di pazienti, il nostro gruppo ha ottimizzato il metodo segnalato attraverso l’uso di una colonna di cromatografia a fase inversa di dimensioni dei pori più piccolo (2,6 µm, C8 100 Å; 50 x 2.1 mm) e un sistema solvente gradiente ( 0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: detenuta al 70% B; 2,7-2,8 min: 70-90% B; 2,8-4,0 min: 90% lavaggio B; 4.0-4,1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: detenuta al 40% B) invece di un’eluizione isocratica. L’obiettivo di questo studio era quello di ridurre i tempi di analisi di HPLC-MS per campione drammaticamente da ~ 15 min a solo 6 min per campione, che è essenziale per l’analisi di una grande quantità di campioni di pazienti. Questo metodo vantaggioso sarà di notevole utilità per gli studi di relazioni esposizione-risposta tra queste droghe CF svolta.
Introduction
Fibrosi cistica (CF) è una comune malattia genetica che coinvolge le ghiandole esocrine muco di polmone, fegato, pancreas e intestino provocando progressiva insufficienza multi-organo, come ad esempio un declino della funzione polmonare e insufficienza pancreatica1, 2,3. Ivacaftor (IVA) è il primo Food and Drug Administration (FDA-US) e Agenzia europea dei medicinali (EMA) ha approvato la fibrosi cistica trans-membrana conduttanza regolatore (CFTR) potenziatore farmaco, con efficacia clinica dimostra producendo un significativo miglioramento nella funzione polmonare rispetto al placebo in un piccolo sottoinsieme dei pazienti CF cuscinetto G551D-CFTR [glicina (G) in posizione 551 è sostituita da acido aspartico (D)] mutazione di senso sbagliato (~ 4-5% della popolazione CF)4,5. Questo oralmente amministrato droga aumenta il canale CFTR aprire, così aumentando il flusso di ioni cloruro e che agiscono per il difetto primario che conduce alle manifestazioni cliniche di CF4,6. Purtroppo, l’IVA in monoterapia non è efficace in pazienti con la mutazione F508del omozigote più comune [in omissione della struttura del gene CFTR che provoca la perdita di fenilalanina (F) in posizione 508] che si traduce in misfolded CFTR, che è visto in circa 50% di la popolazione CF7,8.
Recentemente, il FDA ha concesso l’approvazione per la combinazione di IVA con il correttore CFTR droga lumacaftor. La strategia intelligente di combinare un correttore CFTR (lumacaftor, LUMA) che salva F508del-CFTR alla superficie delle cellule con un modulatore (IVA) che rafforza l’attività canale CFTR, efficacemente si espande la finestra di trattamento per la maggior parte della popolazione CF5 . Domande rimangono sopra se queste droghe soddisfare loro promessa come un numero di rapporti conflittuali è emerse che messo in dubbio sulla loro efficacia clinica9,10. Inoltre, miglioramenti nella funzione polmonare sono stati solo modesti (2.6-4% per la combinazione di ivacaftor-lumacaftor) rispetto al successo raggiunto con IVA in monoterapia in pazienti portatori di una mutazione (10.6-12,5%) di G551D8. Potenziali interazioni farmaco-farmaco antagonista tra IVA e LUMA che potenzialmente limitare l’efficacia clinica di ivacaftor-lumacaftor combinazione provengono dalla sua proprietà farmacocinetiche meno ideale7,11. IVA è ampiamente metabolizzata dagli enzimi del citocromo P450 (CYP), principalmente per un metabolita attivo idrossimetil-IVA (IVA-M1, M1) e una forma inattiva IVA-carbossilato (IVA-M6, M6)7,12. Induttore del CYP3A4, LUMA, d’altra parte, non è ampiamente metabolizzato e in gran parte viene escreta immodificata nelle feci11. Come induttori di CYP3A4 inducono il metabolismo del citocromo, concentrazioni di ivacaftor (substrato del CYP3A4) potrebbero essere ridotto. Inoltre, sia IVA e LUMA sono molecole molto idrofobe e sono ~ 99% legato alle proteine plasmatiche, che limita notevolmente la concentrazione di farmaco libero (attivo)1,13.
Collettivamente, questi fattori possono essere venuta insieme a limitare l’efficacia clinica di combinazione di ivacaftor-lumacaftor. Non è noto se le concentrazioni plasmatiche ottimali sono raggiunti sotto l’attuale regime di dosaggio per combinazione di ivacaftor-lumacaftor o se la soglia terapeutica è mantenuta8. Attualmente, ci è una scarsità di informazioni per quanto riguarda i parametri farmacocinetici come il picco e le concentrazioni plasmatiche allo steady-state di ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor. Dato il metabolismo noto di ivacaftor e lumacaftor, monitoraggio delle relazioni esposizione-risposta è il requisito per raggiungere regimi di dosaggio ottimale per il trattamento di ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor. Il nostro gruppo ha recentemente pubblicato il primo metodo HPLC/LC-MS per il monitoraggio delle relazioni di esposizione-risposta di IVA e LUMA14. Nessun tecniche alternative di misurare le concentrazioni di ivacaftor, suoi metaboliti e lumacaftor sono stato segnalato fin qui. Per consentire l’analisi di alto-rendimento di un collettivo più grande paziente e ridurre drasticamente i tempi di analisi, il nostro gruppo ha ottimizzato il metodo segnalato attraverso l’uso di una colonna di cromatografia a fase inversa di dimensioni dei pori più piccola e un sistema solvente gradiente che riduce i costi e tempi di esecuzione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Come precedentemente segnalato, il nostro gruppo ha per la prima volta sviluppato e convalidato un metodo HPLC e LC-MS per tempestiva rilevazione e quantificazione di ivacaftor e dei suoi principali metaboliti M1 idrossimetil-IVA (attivo) e IVA-carbossilato M6 (inattivo); e lumacaftor nel plasma e dell’espettorato di pazienti CF14. Il saggio segnalato dal nostro gruppo precedentemente è stato usato con successo per quantificare la concentrazione di LUMA, IVA, IVA-M1 e IVA-M6 nel plasma ed espetto…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.L. e T.V. sono supportati dal National Institute of Allergy e malattie infettive (NIAID) dei National Institutes of Health (R01 AI111965). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institute of Allergy e malattie infettive o il National Institutes of Health. MC è un australiano NHMRC Principal Research Fellow. J. L. è un Australian National Health and Medical Research Consiglio (NHMRC) Senior Research Fellow, e T.V. è un australiano NHMRC industria carriera sviluppo livello 2 Research Fellow. E.K.S è un nominato giovane ambasciatore 2017 per ASM (American Society for Microbiology) ed è supportato da Australian Postgraduate Award.
Parti di questo lavoro è stato presentato presso la 12th Australiasian conferenza sulla fibrosi cistica In Melbourne (5-8th di agosto 2017).
Materials
| IVA (Cat#S114) | SelleckChem (USA). | ||
| LUMA (Cat#S1565) | SelleckChem (USA). | ||
| IVA-carboxylate (Cat# 510242247CS) | Clearsynth (Canada). | ||
| hydroxymethyl-IVA (Cat# 510240849CS) | Clearsynth (Canada). | ||
| Methanol (MeOH, LC-MS grade), | Sigma-Aldrich | ||
| acetonitrile (ACN, LC-MS grade) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid (FA) | Sigma-Aldrich | ||
| triple-quadrupole Shimadzu 8030 LC-MS | |||
| Phenomenex Kinetex (2.6 µm C8 100 Å; 50 × 2.1mm) | |||
| (KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0.5 m Depth Filter x 0.004inID). | |||
| 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tube (VWR). | |||
| Eppendorf Centrifuge 5430 | |||
| 13-mm syringe filter (0.45 µm nylon, GRACE, USA) | |||
| [Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 µL, PTFE/Silicone septa]. |
Riferimenti
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