שילוב Ivacaftor ivacaftor-lumacaftor הן שתי תרופות CF חדש. עם זאת, יש עדיין מחסור ההבנה שלהם PK/PD, פרמקולוגיה. אנו מציגים טכניקה HPLC-MS ממוטבים לניתוח בו זמנית של ivacaftor שלה מטבוליטים הגדולות ואת lumacaftor.
פגמים המתקן מוליכות הטרנס-הממברנה סיסטיק פיברוזיס (CFTR) הן הגורם סיסטיק פיברוזיס (CF), מחלה עם סכנת חיים ביטויים ריאתי. Ivacaftor (IVA) ivacaftor-lumacaftor (LUMA) שילוב שתי תרופות פריצת דרך CF חדש ישירות לווסת את הפעילות וסחר של החלבון-CFTR פגומים בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. עם זאת, יש עדיין מחסור של הבנה על פרמטרים פרמוקוקינטיים/pharmacodynamic פרמקולוגיה של ivacaftor ושל lumacaftor. הטכניקה HPLC-MS לניתוח בו זמנית של הריכוזים של ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate ו- lumacaftor של נוזלים ביולוגיים בחולים שקיבלו תקן שילוב ivacaftor או ivacaftor-lumacaftor טיפול כבר בעבר שפותחה על ידי הקבוצה שלנו ואומת חלקית בתקני ה-FDA. עם זאת, כדי לאפשר ניתוח תפוקה גבוהה של מספר גדול יותר של דוגמאות החולה, הקבוצה שלנו יש אופטימיזציה שיטת דיווח באמצעות עמודה הפוכה-שלב בקבוקים קטנים נקבובית גודל (2.6 מיקרומטר, C8 100; 50 x 2.1 מ”מ) ו (מערכת ממיס צבע של 0-1 דקות: 40% ב’; 1-2 דקות: 40-70% ב’; מינימום 2-2.7: שנערך ב-70% ב’; 2.7-2.8 מין: 70-90% ב’; 2.8-min 4.0: 90% B כביסה; 4.0-4.1 מין: 90-40% ב’; 4.1-6.0 מין: שנערך ב- 40% B) במקום • תנאי איזוקראטית. מטרת מחקר זה הייתה כדי לצמצם את הזמן ניתוח HPLC-MS עבור דגימה באופן דרמטי מ ~ 15 דקות רק 6 דקות לכל דגימה, אשר חיוני לניתוח של כמות גדולה של דגימות החולה. שיטה זו מועיל יהיה של השירות ניכר ללימודים למערכות יחסים חשיפה-תגובה של תרופות אלו CF פריצת דרך.
סיסטיק פיברוזיס (CF) היא מחלה גנטית נפוצה מעורבים בלוטות הריר אקסוקרינית של הריאות, הכבד, הלבלב, המעי גורם לכשל איברים רב פרוגרסיבי, כגון ירידה תפקוד הריאות, הלבלב אי ספיקה1, 2,3. Ivacaftor (IVA) הראשון המזון והתרופות (FDA-ארה ב), סוכנות התרופות האירופית (EMA) אישרה סיסטיק פיברוזיס הטרנס-הממברנה מוליכות הרגולטור (CFTR) potentiator סמים, עם יעילות קלינית evidenced ייצור משמעותי שיפור בתפקודי הריאה מעל פלצבו תת קבוצה קטנה של חולי סיסטיק פיברוזיס הנושאת את G551D-CFTR [גליצין (G) בעמדה 551 מוחלף על ידי חומצה אספרטית (D)] missense מוטציה (~ 4-5% מהאוכלוסייה CF)4,5. זה בעל-פה מנוהל סמים מגביר את הערוץ CFTR פתיחה, ובכך מגדילים את זרם יון כלוריד של משחק את הפגם העיקרי שמוביל המאפיינים הקליניים של CF4,6. למרבה הצער, IVA יחידני אינו יעיל בחולים עם המוטציה נפוץ יותר F508del homozygous [במחיקת מסגרת הגן CFTR אשר גורמת לאובדן של פנילאלנין (נ) במיקום 508] שתוצאתה misfolded CFTR, אשר נראה ב ~ 50% CF האוכלוסייה7,8.
לאחרונה, ה-FDA העניק אישור עבור שילוב IVA עם מתקן CFTR סמים lumacaftor. האסטרטגיה המתוחכם של שילוב של מתקן CFTR (lumacaftor, LUMA) אשר מצילה F508del-CFTR השטח תא עם אפנן (IVA) אשר potentiates CFTR ערוץ פעילות, ביעילות מרחיבה את החלון הטיפול רוב האוכלוסייה CF5 . שאלות נותרו על תרופות אלו ימלא את ההבטחה שלהם כפי הופיעו מספר דיווחים סותרים הספק יצוק על היעילות הקלינית שלהם,9,10. בנוסף, שיפור תפקוד הריאות היו צנועים (2.6-4% בלבד עבור שילוב ivacaftor-lumacaftor) לעומת ההצלחה מושגת עם יחידני IVA אצל חולים הנושאת מוטציה (10.6-12.5%) G551D8. אינטראקציות-תרופתיים אויבת פוטנציאלית בין IVA וכי LUMA העלול להגביל את היעילות הקלינית של שילוב ivacaftor-lumacaftor באים שלה פחות אידיאלי של המאפיינים פרמוקוקינטיים7,11. IVA עובר מטבוליזם בהרחבה על ידי ציטוכרום P450 אנזימים (CYP), בעיקר כדי של המטבוליט הפעיל hydroxymethyl-IVA (IVA-M1, M1) וטופס לא פעיל IVA-carboxylate (IVA-M6, M6)7,12. משרן CYP3A4 LUMA, מצד שני, היא לא בהרחבה חילוף חומרים, מופרש בעיקר לא השתנה בתוך צואה11. כפי CYP3A4 inducers זירוז חילוף החומרים ציטוכרום, ריכוזי ivacaftor (CYP3A4 המצע) יכול להיות מופחת. יתר על כן, IVA והן LUMA מולקולות הידרופוביות מאוד, ~ 99% מאוגדים פלזמה חלבונים, אשר באופן משמעותי מגביל את ריכוז סמים (פעילים) חינם1,13.
באופן קולקטיבי, גורמים אלה אולי יבוא יחד כדי להגביל את היעילות הקלינית של שילוב ivacaftor-lumacaftor. לא ידוע אם ריכוזים מיטביים פלזמה מושגות תחת משטר המינון הנוכחי עבור שילוב ivacaftor-lumacaftor או אם הסף הטיפולי נשמר8. תוך זמן קצר, יש במחסור של מידע לגבי פרמוקוקינטיים פרמטרים כגון הפסגה וריכוזי הפלסמה מצב יציב של ivacaftor או ivacaftor-lumacaftor. בהינתן החומרים ראוה של ivacaftor ו- lumacaftor, פיקוח על מערכות יחסים חשיפה-תגובה הוא נחוץ כדי להשיג משטרי המינון האופטימלי לטיפול ivacaftor או ivacaftor-lumacaftor. הקבוצה שלנו לאחרונה לאור השיטה HPLC/LC-MS הראשונה עבור בקרה של מערכות יחסים חשיפה-תגובה של IVA, LUMA14. אין טכניקות חלופיות של מדידת ריכוז ivacaftor שלה מטבוליטים, lumacaftor דווחו עד היום. כדי לאפשר ניתוח תפוקה גבוהה של קולקטיב המטופל גדול יותר, כדי להפחית באופן משמעותי את זמן הניתוח, הקבוצה שלנו כולל אופטימיזציה שיטת דיווח באמצעות עמודה הפוכה-שלב בקבוקים קטנים נקבובית גודל ומערכת ממיס צבע זה מפחית את עלות ושעות פועל.
כפי שדווח בעבר, הקבוצה שלנו יש בפעם הראשונה שפותחה ואומת שיטה HPLC ו- LC-MS מהירה זיהוי, כימות של ivacaftor מטבוליטים הגדולות שלו hydroxymethyl-IVA M1 (פעיל) ו- M6 IVA-carboxylate (לא פעיל); lumacaftor פלזמה, ברוק של חולי CF14. וזמינותו שדווחו על-ידי הקבוצה שלנו בעבר שימש בהצלחה כדי לכמת את ריכוז LUMA, IVA, IVA-M1 ו- IVA-M6 ב פ…
The authors have nothing to disclose.
J.L. T.V. נתמכים על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) של מכוני הבריאות הלאומיים (R01 AI111965). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח התצוגות הרשמי של המכון הלאומי של האלרגיה, מחלות זיהומיות או מכוני הבריאות הלאומיים. MC הוא NHMRC האוסטרלי חוקר בכיר. ג’ ל’ הוא אוסטרלי הלאומי לבריאות ו המועצה למחקר רפואי (NHMRC) עמית מחקר, בטלויזיה האוסטרלי NHMRC התעשייה הקריירה פיתוח ברמה 2 עמית מחקר. E.K.S 2017 השגריר הצעיר שנקבע עבור ASM (החברה האמריקאית למיקרוביולוגיה) והיא נתמכת על ידי כל הפרס לתארים מתקדמים אוסטרלי.
חלקים של עבודה זו הוצג ב 12תאנון Australiasian כנס סיסטיק פיברוזיס ב מלבורן (5-8ה של אוגוסט 2017).
IVA (Cat#S114) | SelleckChem (USA). | ||
LUMA (Cat#S1565) | SelleckChem (USA). | ||
IVA-carboxylate (Cat# 510242247CS) | Clearsynth (Canada). | ||
hydroxymethyl-IVA (Cat# 510240849CS) | Clearsynth (Canada). | ||
Methanol (MeOH, LC-MS grade), | Sigma-Aldrich | ||
acetonitrile (ACN, LC-MS grade) | Sigma-Aldrich | ||
formic acid (FA) | Sigma-Aldrich | ||
triple-quadrupole Shimadzu 8030 LC-MS | |||
Phenomenex Kinetex (2.6 µm C8 100 Å; 50 × 2.1mm) | |||
(KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0.5 m Depth Filter x 0.004inID). | |||
1.5 mL polypropylene microcentrifuge tube (VWR). | |||
Eppendorf Centrifuge 5430 | |||
13-mm syringe filter (0.45 µm nylon, GRACE, USA) | |||
[Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 µL, PTFE/Silicone septa]. |