Tirando nanotubi di membrana da vescicole unilamellari gigante

Summary

Molte proteine nella cellula senso e inducono la curvatura della membrana. Descriviamo un metodo per tirare nanotubi di membrana da vescicole lipidiche per studiare l'interazione delle proteine o qualsiasi molecola di curvatura-attivo con membrane curvo in vitro.

Abstract

Il rimodellamento della membrana cellulare è parte integrante di molti fenomeni cellulari, come ad esempio endocitosi, traffici illeciti, la formazione di filopodi, ecc. Molte proteine diverse associano con membrane curve a causa della loro capacità di percepire o indurre la curvatura della membrana. In genere, questi processi comportano una moltitudine di proteine che li rende troppo complessa per studiare quantitativamente nella cella. Descriviamo un protocollo per ricostituire una membrana curvilinea in vitro, che imita una struttura cellulare curva, come il collo di endocitosi. Delle vescicole unilamellari gigante (GUV) viene utilizzata come modello di una membrana cellulare, in cui pressione interna e la tensione superficiale sono controllato con l'aspirazione di una micropipetta. L'applicazione di una forza di trazione di punto su GUV utilizzando pinzette ottiche crea un nanotubo ad alta curvatura collegato ad una membrana piatta. Questo metodo è stato utilizzato tradizionalmente per misurare le proprietà meccaniche fondamentali delle membrane lipidiche, quali rigidità di piegamento. Negli ultimi anni, esso è stato ampliato per studiare come le proteine interagiscono con curvatura della membrana e il modo che interessano la forma e la meccanica delle membrane. Un sistema che unisce la micromanipolazione, microiniezione, Pinzetta ottica e microscopia confocale permette la misura della curvatura della membrana, tensione nelle membrane e la densità di superficie delle proteine, contemporaneamente. Da queste misurazioni, si può dedurre molte importanti proprietà meccaniche e morfologiche del sistema proteina-membrana. Inoltre, abbiamo stendere un protocollo di creazione GUV in presenza di concentrazione salina fisiologica e un metodo per quantificare la densità superficiale delle proteine sulla membrana da intensità di fluorescenza di etichettato proteine e lipidi.

Introduction

Molti processi cellulari, come endocitosi, traffici illeciti, la formazione di filopodi, infezione, ecc., sono accompagnati da un drammatico cambiamento nella forma di membrane cellulari^1,2. Nella cella, un numero di proteine partecipa a questi processi legandosi alla membrana e alterare la loro forma. Gli esempi più notevoli sono membri della famiglia di proteine Bin/anfifisina/Rvs (BAR), contenente una caratteristica intrinsecamente curvata BAR dominio^3,4,5,6,

Protocol

1. preparazione del Guv da Electroformation su Pt-fili

1. Pulire la camera di electroformation (Vedi Introduzione e Figura 1A) e i Pt-fili con un solvente organico come etanolo o acetone per lavare via i lipidi e con acqua per lavare via i sali.
   Nota: Consigliamo di lasciare asciugandosi il residuo con tessuto imbevuto di etanolo prima sonicating in acetone, etanolo, quindi acqua, ciascuno per 5 min.
2. Preparare una miscela di lipidi di una composizione lipidica desiderata a 1 mg/mL in cloroformio. Il mix deve contenere ~ 0.05% frazione molare di un lipide coniugato con biotina (ad es., 1,2-dist....

Results

L'esperimento di tubo-tirando può dare informazioni vitali meccaniche su membrana. In assenza di proteine o altre molecole che forza la coppia con curvatura della membrana, la membrana e raggio del tubo può essere correlato con tensione nelle membrane applicando l'Hamiltoniana di carnevali-Helfrich equazione ad un tubo tirato da un GUV^50,51

Discussion

Il metodo di tirare tubi da GUV dà ricco di informazioni sul sistema proteina di membrana, come non è solo il mezzo per misurare le proprietà meccaniche fondamentali della membrana, ma aiuta a far luce sull'accoppiamento tra membrana e proteine curvatura. Come discusso nell'introduzione, esistono altre tecniche per misurare gli effetti delle proteine di membrana-curvatura, o incubando le proteine con liposomi di sub-micron legati a una superficie passivata^18,19 ,.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosfatidilcholine (DOPC)	Avanti	850375	Esempio di lipidi utilizzati nei dati per la Figura 3
1,2-distearoil-sn-gliccerone-3-fosfoetanolammina-N-[biotinil(polietilenglicole)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotina]	Avanti	880129	lipide biotinilato
BODIPY-TR-C5-ceramide	Molecular Probes (ThermoFisher)	D7540	lipidi fluorescenti
BODIPY- FLC5-esadecanoil fosfatidilcolina (HPC*)	Molecular Probes (ThermoFisher)		lipidi fluorescenti per calibrazione
densità proteica uovo L-&alfa;-fosfatidilcolina (eggPC)	Avanti	840051	utilizzato per calibrare il raggio del tubo costante
β-caseina da latte bovino (>99%)	Sigma Aldrich	C6905	utilizzato per la passivazione della micropipetta e il camera sperimentale
Saccarosio	Sigma Aldrich	S7903
D(+) glucosio	Sigma Aldrich	G7021
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
Tris	Sigma Aldrich 10708976001
osmometro	Loser	n/a
Pt-wires, diametro 0,5 mm, puro al 99,99%	Goodfellow USA	PT005139	utilizzato per
il generatore		n/a	utilizzato per creare corrente per
il sigillante di stucco	Vitrex (da CML France)	CRIT 140013	utilizzato per sigillare la camera di elettroformazione
del bagno sonicatore		n/a	utile per pulire la camera di elettroformazione, ma non cruciale
Microscopio invertito Nikon TE2000, sistema confocale eC1 (Nikon), con due linee laser (λ = 488 nm e 543 nm); pinzette ottiche indotte da un laser a onda continua in fibra di itterbio da 5 W (λ > 1070 nm; IPG GmBH Germania)			un esempio di sistema di microscopia confocale dotato di pinzette ottiche,
micromanipolatori		n/a,
capillari borosilicati (con raggi interni ed esterni rispettivamente di 0,78 mm e 1 mm)	Harvard apparatus	30-0036
estrattore per micropipette	Sutter Instrument	P-2100
microforge	Narishige	MF-800
	Physik Instrumente	n/a
perle rivestite di polistirene streptavidina (diametro 3,2 & micro; m)	Spherotech	SVP-30-5