거 대 한 Unilamellar 소포에서 막 나노튜브를 당기

Summary

셀에 많은 단백질을 감지 하 고 막 곡률을 유도. 곡선된 막 체 외단백질 또는 어떤 곡률 활성 분자의 상호작용을 연구 하는 지질 소포에서 막 나노튜브를 당겨 하는 방법을 설명 합니다.

Abstract

세포 막의 재편 endocytosis, 인신 매매, 등 filopodia형성 등 많은 세포 현상의 중요 한 부분입니다. 많은 다른 단백질 그들의 능력을 감지 하거나 유도 막 곡률 때문에 곡선된 멤브레인과 연결 합니다. 일반적으로 이러한 프로세스는 다양 한 단백질 셀에서 양이 많게 공부 하기에 너무 복잡 하 포함 한다. 우리는 endocytic 목 같은 곡선된 세포 구조를 흉내 낸는 곡선된 막에 생체 외에서다시 구성할 프로토콜을 설명 합니다. 거 대 한 unilamellar 소포 (우두머리)는 그의 내부 압력 및 표면 장력 micropipette 포부와 함께 제어 되는 세포 막의 모델로 사용 됩니다. 광학 핀셋을 사용 하 여 우두머리에는 포인트 당기는 힘을 적용 평면 막에 연결 된 높은 곡률의 나노튜브를 만듭니다. 이 방법은 전통적으로 굽 힘 강성 등 지질 막의 기본적인 기계적 특성을 측정 하기 위해 사용 되었습니다. 최근 몇 년 동안, 그것은 단백질 막 곡률 및 그들은 모양과 막의 역학에 영향을 미칠 방법으로 상호 작용 하는 방법을 공부 하 확장 되었습니다. Micromanipulation, microinjection, 광학 핀셋, confocal 현미경 검사 법을 결합 한 시스템 동시에 막 곡률, 막 긴장, 그리고 단백질의 표면 밀도의 측정을 허용 한다. 이 측정에서 단백질 막 시스템의 많은 중요 한 기계 및 형태학 속성 유추 수 있습니다. 또한, 우리 하다 생리 소금 농도 형광 강렬 레이블이 단백질과 지질에서에서 막에 단백질의 표면 밀도 측정 하는 방법의 GUVs를 만드는 프로토콜.

Introduction

Endocytosis, 인신 매매, filopodia, 감염 등의 형성 등 많은 세포질 과정 세포 막^1,2의 모양에 있는 극적인 변화를 함께 제공 됩니다. 셀에 다양 한 단백질 막에 바인딩 및 그들의 모양을 변경 하 여 이러한 프로세스에 참여 하 고. 가장 주목할 만한 보기는 본질적으로 도메인^3,,45,,67바 곡선 특성을 포함 하는 빈/Amphiphysin/Rvs (바) 단백질 가족의 일원. 일반적으로, 그들은 표면에 그리고, 많은 경우에, 또한 얕게 삽입은 bilayer amphipathic 나선 바 도메인 준수는 막으로 작용. 모양, 크기, 및 amphipathic 나선 수와 함께 바 도메인의 결정: (1) 막 곡률의 방향 (즉, 여부 그들은 invaginations 또는 돌출을 유발 한다), 및 (2) 막의 크기 곡률의^5,8. 노트, 여기 긍정적인 곡률 달리 곡선된 막, 즉, 상호 작용 입자, 그리고 부정적인 돌출의 볼록한 쪽으로 정의 됩니다. 또한, 단백질 바의 양적 연구는 막에 그들의 효과 물리적 매개 변수 집합에 따라 달라 집니다 공개: 표면 단백질, 막 긴장, 그리고 막 모양 (평면 대 관 대 구형의 밀도 모양)⁷. 단백질 바 이러한 매개 변수에 따라 수 있습니다: (1) 막 곡률의 센서 역할 (2) 구 부 막, 또는 (3) 유도 막 절단⁷.

막 셀에 재편 endocytosis, 같은 현상의 양적 측면을 공부에 관련 된 부품의 투명 한 수 비보에 매우 도전 이다. 최소한의 구성 요소를 셀에 곡선된 막을 흉내 낸의 생체 외에서 재구성 어떻게 막 커브 단백질의 작동 기계 이해를 얻기 위하여 수단을 제공 합니다. 이 문서는 막 나노튜브에서 생체 외에서 micromanipulation, confocal 현미경 검사 법, 광학 핀셋을 사용 하 여 다시 구성할 프로토콜을 설명 합니다. 접근은 공부 하 고, 양적 방법, 단백질, 지질, 또는 작은 분자 곡선된 막 상호 작용 하는 방법을 사용할 수 있습니다. GUVs 지질 누구의 곡률 막 커브 상호 작용 분자의 크기에 비해 무시할 수은 세포 막의 모델로 사용 됩니다. 그들은 electroformation 방법⁹ 는 소포 지질 영화를 수 화와 교류 전류 (AC)¹⁰에서 GUVs로 붓기 형성 된다를 사용 하 여 준비 된다. 가장 일반적인 기판 GUVs 재배 되는 인듐 주석 산화물 (ITO) 코팅 중 반 전도성 격판덮개 또는 백 금 철사 (Pt-전선)¹¹. 이 작품에서는, GUVs는이 방법은 버퍼¹²소금의 면 전에 서 GUVs를 만드는 대안 보다 훨씬 더 잘 작동 하도록 표시 되었습니다로 Pt-전선에 재배 됩니다. Electroformation 프로토콜은 여기에 설명 된 그것을 재현 하는 충분 한 세부 사항에, 하지만 우리는 비슷한 다른 메서드와 GUVs를 만드는 세부 사항^13,14에서 설명 되었습니다 이전 기사에 독자를 참조 하십시오. 우리 손에 Pt 전선에 electroformation는 성공적으로 나왔고 GUVs 또는 자연 지질 합성 지질의 혼합에서 ~ 100 m m NaCl을 포함 하는 버퍼에 추출 물. 또한, 성장 하는 동안 GUVs 내부 단백질을 캡슐화 가능 했다 또한. 예를 들어 electroformation 챔버는 그림 1A;에 나와 그것은 2 ~ 10 cm 긴 Pt-와이어 홀더 유리 coverslips와 양쪽에 밀봉 될 수 있다 소계 (PTFE)에서 만든 삽입 구성 ~ 1-2 c m 간격 (그림 1A).

그림 1: 실험적인 체제. Pt-와이어에 연결 된 전기 커넥터 (A) 우두머리 electroformation 챔버. (B) 왼쪽: 현미경을 보여주는 실험 시스템, 목표 및 2 개의 micropipettes (왼쪽 및 오른쪽) 위 실험 챔버는 micromanipulators에 연결 된 고 튜브 고 단백질에 대 한 실험 챔버에 삽입 사출입니다. 오른쪽: 실험 챔버의 근접 보기는 포부와 삽입 분사 micropipettes의 끝을 보여주는 목표 위에 탑재. (C) 주사기의 백 엔드에 micropipette 삽입 얇은 디스펜서 장비. 하단의 파란색 점선 개요는 micropipette micropipette 내부 디스펜서의 근접 보기입니다. 이 시스템은 카 세 인 유리 표면 passivate 하 고 필요할 때 미네랄 오일 칠을 다시 하는 micropipette 채우기 위해 사용 됩니다. (D) A 시스템 µ L 양의 단백질 해결책을 발음 하는 데 사용 합니다. 바늘은 주사기와 주입 micropipette에 연결 된 튜브에 연결 되어 있습니다. Micropipette 팁 신중 하 게 단백질 해결책에 몰입 하 고 그렇게 발음 하는 micropipette 팁을 채우기 위해. micropipette 다음 다시 채워집니다 미네랄 오일 패널 C.에에서 표시 하는 시스템을 사용 하 여 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

막 나노튜브, 7에서 반경에 이르기까지 몇 백 nm nm는 우두머리에서 외부 힘으로 당길 수 있다. 이 방법은 처음 세포 막 및 소포, 휨 강성^15,16등의 탄성 속성 측정 하도록 설계 되었습니다. 가장 최근 작품, 메서드 가져온된 나노튜브^7,17근처 단백질 microinjecting 곡선된 멤브레인과 단백질의 상호 작용 연구를 확대 되었다. 다른 방법 막 커브 단백질 연구 개발 되었습니다. 한 방법에서는, 단백질 세 표면에 닿는 곳에 다르게 크기의 리와 알을 품는. Confocal 현미경 검사 법은 단백질 바인딩 곡률을 이용한 정렬^18,19를 나타낼 수 있는 liposome 직경의 함수로 측정 하는 데 사용 됩니다. 다른 방법에서는, 단백질 tubules^20,21을 자발적으로 유도 하는 능력을 측정 하기 위해 마이크로 발음 하는 우두머리 근처 주입 됩니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 방법을 막 커브 단백질 endocytosis에 관련 된 공부에 특히 적합 한은 대부분 단백질이 일반적으로 미리 형성한 막 나노튜브와 함께 화물 포함 된 막 invagination 연결을 발생 합니다 평면 플라즈마 멤브레인 기본 또한,이 방법에서는, 달리 곁된 작은 리와 분석 결과에 막 나노튜브는 지속적으로에 연결 막; 따라서, 그것은 한 상황으로 예상 vivo에서우두머리와 기계적 평형 에입니다. 따라서, 근본적인 막 물리학 적용 하 고 우리가 우리의 측정^22,,2324에서 기계적 특성의 과다를 추정할 수 있다.

이 방법의 전체 구현에 대 한 필요한 장비는 confocal 현미경, 광학 핀셋, 그리고 하나 또는 두 개의 micropipettes 물 탱크 (그림 1B)에 연결을 포함 합니다. 모든 3 개를 결합해 서, 동시에 막 긴장, 막 곡률, 단백질의 표면 밀도 측정 하 고 힘²⁵를 튜브에 가능 하다. Micropipette 포부 필수적 이며, 그것은 쉽게 액체 정역학 압력을 통해²⁶포부 압력 제어 하는 물 탱크에 연결 홀더 유리 제 micropipette 삽입 하 여 구성 됩니다. micropipette 홀더는 제어는 micromanipulator 고, 이상적으로, 한 방향으로 정밀 운동 위한 압 전 액추에이터. 나노튜브를, microaspirated 우두머리는 짧게 미크론 크기의 구슬을 다음 멀리는 나노튜브를 만드는에 붙어 됩니다. 이 구현에는 구슬²⁷게시 된 프로토콜 따라 생성 될 수 있다 광학 족집게에 의해 개최 됩니다. 그것이 비록 정확한 힘 측정 비용 다른 방법으로, 광학 족집게 및 풀 나노튜브의 분배 가능 합니다. 광학 트랩을 만들려고 너무 어려운 경우 또는 힘 측정은 중요 하지,와 같은 경우 단순히 곡선된 멤브레인에 대 한 단백질의 선호를 확인 하 고 싶어 하는 경우 튜브 발음 하는 두 번째 micropipette²⁸의 끝에 비드를 사용 하 여 가져온 수 있습니다. 그것은 또한^30,31흐름 또는 중력²⁹ 를 사용 하 여 튜브를 당겨 수 있습니다. 또한, confocal 현미경 검사 법 중요 하지 않습니다. 그러나, 그것은 단백질의 표면 밀도 측정 하기 위해 그렇게 선호. 그것은 또한 지질 막 힘 및 긴장은 별도로 따라서 튜브의 형광 강도에서 나노튜브 반경 측정 있습니다. 형광에서 추론 튜브 반경 이러한 수량 사이의 관계 막 준수 단백질²⁵의 존재로 인해 잘 설립 방정식에서 일탈 하는 경우에 특히 중요 하다. 중요 한 것은, 하나로 튜브 곡률을 측정할 수 있을 것입니다 광학 트랩 confocal 현미경 검사 법의 분배 수 없습니다.

이 프로토콜에서 설명 된 대로 메서드 나노튜브는 바 가족^{25,,3233,34에서에서 주로 그들에 다양 한 주변 막 단백질의 곡률을 이용한 정렬 공부 하는 데 사용 되었습니다.} . 그것은 또한 KvAP에 농축 conically 모양의 막 횡단 칼륨 채널 단백질³⁵바 같은 방식으로 나노튜브 곡선을 표시 했다. GUVs 내부 단백질을 캡슐화 하는 메서드를 최적화 하 여 부정적인 곡률과 단백질의 상호 작용은 최근 조사 잘³⁶로. 또한,이 메서드는 사용 단백질 건설 기계^25,37 의 형성을 명료 하 고 중 선 긴장³⁸단백질 dynamin³⁹, 또는 바 막 절단의 메커니즘을 연구 하 단백질^40,41. 뿐만 아니라 단백질, 작은 분자 또는 이온 곡률을 유도할 수 있다 또한. 이 메서드를 사용 하 여 칼슘 이온 소금 없는 조건⁴²에서 긍정적인 곡률을 유도 하기 위해 표시 했다. 흥미롭게도, 그것은 또한 보였다 지질 demixing 포인트^43,44근처는 작곡에만 있지만 정렬, 곡률을 받을 수 있습니다. 합계에서는, 연구원은 어떻게 중 정수 막 구성 요소 (예:, 지질 또는 막 횡단 단백질) 조사에 관심이 메서드를 사용할 수 있습니다 또는 주변 분자 바인딩 (중 내부 또는 외부 GUVs)와 상호 작용 기계 및 양적 관점에서 원통 곡선된 막 그것은 또한^22,,2345막 자체의 기계적 성질 측정에 관심 있는 사람을 위한 것입니다.

Protocol

1. Pt-와이어에 Electroformation에 의해 GUVs의 준비 Electroformation 챔버 청소 ( 소개 및 그림 1A참조)와 Pt-전선 에탄올 또는 지질을 멀리 세척 하는 아세톤 등 유기 용 매와 물으로 씻어 소금에.참고: 우리는 철저 하 게 에탄올-젖은 티슈로 잔류물을 멀리 닦아 다음 아세톤, 에탄올, 각각 5 분 동안 물에서 sonicating 제안. 클로 프롬에 1 mg/mL에서 원하는 지질 …

Representative Results

튜브를 당기 실험 멤브레인에 대 한 중요 한 기계적인 정보를 줄 수 있습니다. 단백질 또는 다른 분자를 막 곡률, 막와 커플 하 고 튜브 반경 막 긴장 Canham Helfrich 해밀턴을 적용 하 여 관련 될 수 없을 경우에는 튜브를 방정식 우두머리50,51에서 가져온 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_uplo…

Discussion

하지만, 막의 기본적인 기계적 특성 측정을 의미 하지만 단백질 및 막 간의 결합에 빛을 발산 하는 데 도움이 막 단백질 시스템에 풍부한 정보를 제공 하는 GUVs에서 튜브를 당기기의 방법 곡률입니다. 소개에서 설명 했 듯이, 다른 기술을 서브 미크론 리¹⁹ 세 표면^18,곁에와 단백질을 배양 하거나 관찰 하 여 막 커브 단백질의 효과 측정 하기 위해 존재 합?…

Materials

1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC)	Avanti	850375	Example lipid used in data for Figure 3
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin]	Avanti	880129	biotinylated lipid
BODIPY-TR-C5-ceramide	Molecular Probes (ThermoFisher)	D7540	fluorescent lipid
BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*)	Molecular Probes (ThermoFisher)		fluorescent lipid for protein density calibration
egg L-α-phosphatidylcholine (eggPC)	Avanti	840051	used for calibrating the tube radius constant
β-casein from bovine milk (>99%)	Sigma Aldrich	C6905	used for passivating the micropipette and the experimental chamber
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
D(+) glucose	Sigma Aldrich	G7021
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
Tris	Sigma Aldrich	10708976001
osmometer	Loser	n/a
Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure	Goodfellow USA	PT005139	used for GUV electroformation
function generator		n/a	used to create current for GUV electroformation
putty sealant	Vitrex (from CML France)	CRIT 140013	used to seal the electroformation chamber
bath sonicator		n/a	useful to clean the electroformation chamber, but not crucial
Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (λ = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (λ > 1070 nm; IPG GmBH Germany)			an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers
micromanipulators		n/a
borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively)	Harvard apparatus	30-0036
micropipette puller	Sutter Instrument	P-2100
microforge	Narishige	MF-800
piezoelectric actuator	Physik Instrumente	n/a
polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 µm)	Spherotech	SVP-30-5