En Guide til produksjon, krystallisering og proteinstrukturer av menneskelig IKK1/α
Summary
IκB Kinase 1/î± (IKK1/α CHUK) er en Ser/Thr protein kinase som er involvert i et mylder av mobilnettet aktiviteter primært gjennom aktivering av NF-κB transkripsjonsfaktorer. Her beskriver vi de viktigste trinnene som er nødvendig for produksjon og krystall proteinstrukturer av dette proteinet.
Abstract
En klasse ekstracellulære stimuli krever aktivering av IKK1/α å indusere generasjon av en NF-κB-underenheten, p52, gjennom behandling av sin forløper p100. p52 fungerer som en homodimer eller heterodimer med en annen NF-κB-underenheten, RelB. Disse dimers regulere igjen uttrykk for hundrevis av gener involvert i betennelser, celle overlevelse og celle syklus. IKK1/α fortsatt hovedsakelig forbundet med IKK2/β og NEMO som en trefoldig kompleks. Men er et lite basseng av det også observert som en lav molekylvekt complex(es). Det er ukjent om p100 behandling aktiviteten utløses av aktivering av IKK1/α i større eller mindre komplekse bassenget. Konstituerende aktiviteten til IKK1/α påvist i flere kreft og inflammatory lidelser. For å forstå mekanismen av aktivering av IKK1/α, og aktivere bruken som narkotika mål, uttrykte vi rekombinant IKK1/α i andre systemer, som E. coli, insekt, og pattedyrceller. Vi lyktes i å uttrykke løselig IKK1/α i baculovirus infisert insekt celler, skaffe mg mengder av svært ren protein, bandets det i nærvær av hemmere og å bestemme dens X-ray krystallstruktur. Her beskriver vi detaljerte trinn for å produsere rekombinant protein og dens krystallisering sin X-ray krystall proteinstrukturer.
Introduction
Transcriptional aktiviteter av NF-κB dimeric transkripsjonsfaktorer kreves for mangfoldig cellulære funksjoner, fra betennelse og immunitet til overlevelse og død. Disse aktivitetene er strengt kontrollert i celler og tap av forordning fører til ulike pathological betingelser, inkludert autoimmune sykdommer og kreft1,2,3. I fravær av en stimulus holdes aktivitetene til NF-κB hemmet av IκB (Inhibitor av – κB) proteiner4. Fosforylering av bestemte Ser rester på IκB proteiner merkes for ubiquitination og senere proteasomal fornedrelse eller Selektiv behandling5. To svært homologe Ser/Thr kinaser, IKK2/β og IKK1/α, opptre som sentral regulatorer av NF-κB ved å utføre disse fosforylering hendelser6,7.
Interaksjoner mellom en ligand og en reseptor transduces et signal gjennom en rekke meglere fører til aktivering av NF-κB faktorer. NF-κB signal prosessen kan grovt klassifiseres i to forskjellige baner-godkjent og ikke-kanoniske (alternativ)8. Aktiviteten til IKK2/β regulerer primært NF-κB noe av den kanoniske veien som er avgjørende for inflammatoriske og medfødte immunreaksjoner9. En distinkt funksjon i denne veien er en rask og kortvarige aktivering av IKK2/β10 innenfor en hittil biokjemisk uncharacterized IKK komplekse, antas å være sammensatt av IKK1 og IKK2, samt en regulerende komponent, NEMO (NF-κB viktig Modulator )11,12,13. Mellom de to katalytisk IKK underenheter av IKK komplekset, IKK2 er primært ansvarlig14 for fosforylering av bestemte rester av prototypiske IκBs (α, – β, og -γ) bundet til NF-κB, og også en atypisk IκB protein, NF-κB1/p105, som er et forløperen til NF-κB p50 delenhet5. Fosforylering indusert ubiquitination og proteasomal nedbrytning av IκB (eller behandling av p105) fører til utgivelsen og aktivering av et bestemt sett med NF-κB dimers15. Avvikende NF-κB aktivitet på grunn av mis regulert funksjon av IKK2 har blitt observert i mange kreft samt som autoimmune sykdommer2,3,16.
I motsetning til IKK2/β regulerer aktiviteten til IKK1/α NF-κB noe av den ikke-kanoniske veien, som er avgjørende for utvikling og immunitet. IKK1 phosphorylates bestemt rester av NF-κB2/p100 på sitt C-terminalen IκBδ segment, som fører til behandlingen og generering av p52. Dannelsen av transcriptionally aktive p52:RelB heterodimer starter en langsom og vedvarende svar utviklingsmessige signaler,7,,17,,18,,19,,20. Interessant, er generering av den sentrale NF-κB faktor p52 av denne veien kritisk avhengig av en annen faktor, NF-κB Inducing Kinase (NIK)21,22, men ikke på IKK2 eller NEMO. I hvile celler fortsatt nivået på NIK lav grunnet sin konstant proteasome-avhengige fornedrelse23,24,25. Ved stimulering av celler av “ikke-kanoniske” ligander, og i enkelte ondartede celler, NIK blir stabilisert for å rekruttere og aktivere IKK1 / α. Kinase aktiviteter både NIK og IKK1 er avgjørende for effektiv behandling av p100 i p527. IKK1 og NIK phosphorylate tre serines (Ser866, 870 og 872) av NF-κB2/p100 på sitt C-terminalen IκBδ segment fører til behandlingen og generering av p52. Avvikende aktivering av den ikke-kanoniske veien har vært innblandet i mange malignitet inkludert myelom26,27,28.
Flere svært effektiv og spesifikke hemmere mot IKK2/β er kjent, selv om ingen så langt har vist seg for å være et effektivt medikament. IKK1/α-spesifikke hemmere er sparsom. Dette kan stammer delvis fra vår mangel på strukturelle og biokjemiske informasjon på IKK1/α, som begrenser vår forståelse av mekanistisk grunnlaget for aktivering av NF-κB av IKK1 i cellene og rasjonell stoff design. X-ray strukturer av IKK2/β gitt oss innsikt i mekanismen aktivisering IKK2/β29; men disse strukturene ikke kunne avsløre hvordan ulike oppstrøms stimuli utløse aktivering av IKK1/α eller IKK2/β å regulere adskilt apparater av NF-κB aktiviteter 30,31. Å forstå grunnlag mekanistisk underliggende distinkte signalerer funksjon IKK1/α, og å etablere en plattform for rasjonell narkotika design, fokuserte vi på å bestemme strukturen til IKK1/α.
Protocol
Representative Results
Discussion
Produksjon, krystallisering og struktur løsning av to relaterte IKK proteiner
Vi begynte for å bestemme X-ray krystall strukturen av IKK1/α med forestillingen om at det ville være en relativt enkel øvelse gitt vår erfaring med IKK2/β protein produksjon, krystallisering og proteinstrukturer. Men var vi svært overrasket over at disse to relaterte proteiner oppførte seg veldig annerledes om enkel krystallisering. Til tross for forsøk fra flere høyprofilerte laboratorier tok fastsettelse av IKK…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker ansatte ved beamlines 19ID, 24ID og 13ID på Avansert Foton kilde, Lemont, IL, støtte under datainnsamlingen på forskjellige krystaller. Vi er takknemlige for Dmitry Lyumkis, Salk Institute for henting oss lav oppløsning cryo-EM kartet i tidlige stadier av EM kart/modell bygning som ble brukt til å bygge den første IKK1 molekylære erstatning søk modellen. Forskningen førte til disse resultatene har mottatt finansiering fra NIH tilskudd AI064326, CA141722 og GM071862 til GG. SP er Wellcome Trust DBT India mellomliggende Fellow.
Materials
| Cellfectin/Cellfectin II | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II |
| Sf900 III Insect cell medium | Thermo Fisher Scientific | 12658-027 | |
| SF9 cells | Thermo Fisher Scientific | 12659017 | |
| anti-IKK1 antibody | Novus Biologicals | NB100-56704 | Previously sold by Imgenex |
| anti-PentaHis antibody | Qiagen | 34460 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Nitrocellulose can also be used |
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| Bradford assay reagent | BioRad | 500001 | |
| Superdex 200 column | GE Healthcare | 28989335 | |
| Amicon concentrator | Millipore | UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024 | |
| Compound A | Bayer | ||
| Calbiochem IKK-inhibitor XII | Calbiochem | 401491 | |
| Staurosporine | SIGMA | S4400 | |
| MLN120B | Millenium | Gift item | |
| AMPPNP | SIGMA | A2647 | |
| Dextran sulfate | SIGMA | 51227, 42867, 31404, | |
| Dextran sulfate | Alfa Aesar | J62101 | |
| PEG | SIGMA | 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 | Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #. |
| Crystallization Screens | |||
| Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) | Hampton Research | HR2-130 | |
| Index HT | Hampton Research | HR2-134 | |
| PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) | Hampton Research | HR2-139 | |
| PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) | Hampton Research | HR2-086 | |
| SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) | Hampton Research | HR2-136 | |
| Crystal mounts | Hampton Research | HR8-188, 190, 192, 194 | |
| Synchrotron | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory | Beamline 19 ID | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines. |
Riferimenti
- Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. NF-kappaB, an active player in human cancers. Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140 (6), 883-899 (2010).
- Ben-Neriah, Y., Karin, M. Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker. Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).
- Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).
- Karin, M., Ben-Neriah, Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).
- Ghosh, S., Karin, M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell. 109, S81-S96 (2002).
- Sun, S. C. The noncanonical NF-kappaB pathway. Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).
- Bonizzi, G., Karin, M. The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).
- DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).
- Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity. Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).
- Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation. Cell. 91 (2), 243-252 (1997).
- Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex. Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).
- Yamaoka, S., et al. Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation. Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).
- Li, Z. W., et al. The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis. J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).
- Hayden, M. S., Ghosh, S. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell. 132 (3), 344-362 (2008).
- Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity. Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).
- Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells. Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).
- Senftleben, U., et al. Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway. Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).
- Coope, H. J., et al. CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52. EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).
- Dejardin, E., et al. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).
- Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation. The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).
- Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100. Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).
- Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100. J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).
- Zarnegar, B. J., et al. Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK. Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).
- Vallabhapurapu, S., et al. Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling. Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).
- Annunziata, C. M., et al. Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).
- Keats, J. J., et al. Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).
- Staudt, L. M. Oncogenic activation of NF-kappaB. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109 (2010).
- Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS Biol. 11 (6), e1001581 (2013).
- Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).
- Scheidereit, C. IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription. Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).
- Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).
- Polley, S., et al. Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha. Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).
- Otwinowski, Z. a. M., W, Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).
- Liu, S., et al. Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer. J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
- McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
- Vagin, A. T., Teplyakov, A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).
- Brunger, A. T. Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).
- Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).
- McRee, D. E. XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview. J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).
- Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data. Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).
- Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS biology. 11 (6), e1001581 (2013).
- Christopher, J. A., et al. The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).
- Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking crystallographic model and data quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
