Vurdering af dopaminerge homøostase i mus ved hjælp af High-performance væskekromatografi analyse og Synaptosomal dopamin optagelse
Summary
Synaptosomal dopamin optagelse og højtydende væskekromatografi analyse repræsenterer eksperimentelle værktøjer til at undersøge dopamin homøostase i mus ved at vurdere funktionen af dopamin-transporter og niveauer af dopamin i striatal væv, henholdsvis. Her præsenterer vi protokoller for at måle dopamin væv indhold og vurdere funktionaliteten af dopamin-transporter.
Abstract
Dopamin (DA) er en modulerende neurotransmitter kontrollere motorisk aktivitet, belønning processer og kognitiv funktion. Værdiforringelse af dopaminerge (DAergic) neurotransmission er stærkt forbundet med flere centralnervesystemet-associerede sygdomme som Parkinsons sygdom, attention deficit hyperactivity disorder og narkotika afhængighed1,2 ,3,4. Skildrer sygdomsmekanismer involverer DA ubalance er kritisk afhængige af dyremodeller for at efterligne aspekter af sygdomme, og dermed protokoller, der vurderer bestemte dele af DA homeostase er vigtigt at give nye indsigter og mulige terapeutiske mål for disse sygdomme.
Her præsenterer vi to nyttige eksperimentelle protokoller, når de kombineres giver en funktionel læse-out af DAergic systemet i mus. Biokemiske og funktionelle parametre på DA homeostase er opnået gennem vurdering af DA niveauer og dopamin transporter (DAT) funktionalitet5. Når undersøger DA systemet, er evnen til pålideligt måle endogene niveauer af DA fra voksne hjerne afgørende. Derfor præsenterer vi sådan udføre high-performance væskekromatografi (HPLC) på hjernevæv fra mus til at bestemme niveauet af DA. Vi udføre forsøget på væv fra dorsale striatum (dStr) og nucleus accumbens (NAc), men metoden er også egnet til andre områder, DA-innerveres hjernen.
DAT er afgørende for reuptake af DA i den præsynaptiske terminal, derved kontrollere den tidsmæssige og rumlige aktivitet af frigivne DA. Kendskab til niveauer og funktionalitet af DAT i striatum er af stor betydning ved vurderingen af DA homøostase. Her, leverer vi en protokol, der giver mulighed for samtidig udlede oplysninger om overflade niveauer og funktion ved hjælp af en synaptosomal6 DA optagelse assay.
Nuværende metoder kombineret med standard immunoblotting protokoller giver forsker med relevante værktøjer for at karakterisere DAergic system.
Introduction
Dopamin (DA) er en modulerende neurotransmitter kritiske motor adfærd, belønning og kognitiv funktion1,7,8,9. Ubalancer i DA homeostase er impliceret i flere neuropsykiatriske sygdomme som Parkinsons sygdom1, depression, opmærksomhed underskud hyperaktivitet lidelse og narkotikamisbrug. DA er frigivet fra den præsynaptiske neuron i den synaptiske kløft, hvor det binder sig til og aktiverer receptorer på den præ- og postsynaptiske membran, dermed yderligere formidle signalet. DA niveauet i synapse efter udgivelsen er rumligt og tidsligt kontrolleret af DAT3,10. Transportvirksomheden sequesters DA fra det ekstracellulære rum, og dermed opretholder fysiologiske DA niveauer3,11. Genetiske fjernelse af DAT i mus forårsager en hyperdopaminergic fænotype karakteriseret ved forhøjede synaptic DA niveauer, udtømning af intracellulære DA puljer og dybtgående ændringer i postsynaptiske DAergic signalering10,12.
Her, to adskilte protokoller er præsenteret, en metode til foranstaltning DA væv indhold og en anden for at vurdere funktionaliteten af DAT. kombineret med den overflade biotinylation assay beskrevet af Gabriel et al.13 disse to metoder give oplysninger om DA indhold og funktionelle niveauer af DAT for en grundig vurdering af DA homøostase. Med disse metoder kan DA homeostase af forskellige Transgene mus eller sygdomsmodeller karakteriseret og beskrevet. Disse værktøjer er blevet implementeret og optimeret og er standard brug i vores laboratorier. Nuværende assays har tjent til at undersøge konsekvenser på DA homeostase af at ændre C-terminalen DAT14 eller udtrykke Cre recombinase under tyrosin hydroxylase (TH) promotor 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette manuskript beskriver nyttige eksperimentelle protokoller for at afgrænse DA homøostase i en musemodel af valg. Vi leverer detaljerede protokoller for måling niveauer af DA i hjernevæv fra mus ved hjælp af HPLC og synaptosomal DA optagelsen for at vurdere funktionelle DA transport gennem DAT. Procedurer, protokoller og grænser for HPLC eksperiment og synaptosomal DA optagelse assay vil blive uddybet nedenfor.
Synaptosomal optagelse protokol kan give nyttig indsigt til funktionalitet…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af UCPH 2016 Program of Excellence (U.G., A.R., K.J.), Lundbeck Foundation (M.R.) Lundbeckfonden Center for Biomembraner i Nanomedicin (U.G.), National Institute for sundhed tilskud P01 DA 12408 (U.G.), danske Rådet for uafhængige forskning – medicinske videnskaber (U.G.).
Materials
| COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| [3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
| Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
| Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
| Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
| LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
| Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
| Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
| Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
| Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
| Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
| Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
| Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
Riferimenti
- Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum. Neuron. 76, 33-50 (2012).
- Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
- Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).
- Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Monoamine transporters: from genes to behavior. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).
- Runegaard, A. H., et al. Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice. Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).
- Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles (‘synaptosomes’). Biochem J. 90, 293-303 (1964).
- Hornykiewicz, O. Dopamine (3-hydroxytyramine) and brain function. Pharmacol Rev. 18, 925-964 (1966).
- Schultz, W. Behavioral dopamine signals. Trends Neurosci. 30, 203-210 (2007).
- Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
- Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G. Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter. Nature. 379, 606-612 (1996).
- Torres, G. E., Amara, S. G. Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function. Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).
- Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4029-4034 (1998).
- Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. , (2014).
- Rickhag, M., et al. A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter. Nat Commun. 4, 1580 (2013).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
- Whittaker, V. P. Thirty years of synaptosome research. J Neurocytol. 22, 735-742 (1993).
- Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D. Presynaptic regulation of dopaminergic neurotransmission. J Neurochem. 87, 273-289 (2003).
- Yang, L., Beal, M. F. Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson’s disease by HPLC-ECD. Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).
- Earles, C., Schenk, J. O. Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation. Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).
- Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission. J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).
- Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo. J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).
- Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations. J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).
- Hansen, F. H., et al. Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD. J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).
- Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson’s disease. Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).
- Atack, C. V. The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay. Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).
- Yoshitake, T., et al. High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex. J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).
- Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons. Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).
- Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson’s disease. Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).
- Mikkelsen, M., et al. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area. J Vis Exp. , (2012).
- Van Dam, D., et al. Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain. Amino Acids. 28, 377-387 (2005).
- Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods. Front Neurosci. 9 (37), (2015).
- Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day. Neuroscienze. 247, 234-241 (2013).
- Zhuang, X., et al. Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).
- Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).
- Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats. J Vis Exp. , e52468 (2015).
- Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
- Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry. Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).
