Évaluation de l’homéostasie des dopaminergiques chez les souris par l’utilisation de l’analyse de chromatographie liquide à haute performance et l’absorption de la Dopamine
Summary
Capture de la dopamine et de chromatographie liquide à haute performance représentent expérimentale des outils d’analyse pour étudier l’homéostasie de la dopamine chez les souris en évaluant la fonction de transporteur de la dopamine et les niveaux de dopamine dans le tissu du striatum, respectivement. Nous présentons des protocoles afin de mesurer la teneur en tissu dopamine et d’évaluer les fonctionnalités du transporteur de la dopamine.
Abstract
La dopamine (DA) est un neurotransmetteur modulatrice contrôlant l’activité motrice, les processus de récompense et les fonctions cognitives. Altération de la neurotransmission dopaminergique (DAergic) est fortement associée à plusieurs maladies associées au système nerveux central telles que la maladie de Parkinson, troubles de l’attention-hyperactivité et drogues toxicomanie1,2 ,3,4. Délimitant les mécanismes des maladies impliquant le déséquilibre DA critique repose sur des modèles animaux pour imiter les aspects des maladies et des protocoles qui permettent d’évaluer des parties spécifiques de l’homéostasie de la DA sont donc importants de proposer des idées nouvelles et thérapeutique possible cibles pour ces maladies.
Nous présentons ici deux protocoles expérimentaux utiles que lorsqu’il est combiné fournissent un affichage fonctionnel du système DAergic chez la souris. Les paramètres biochimiques et fonctionnelles sur l’homéostasie DA sont obtenus au moyen d’évaluation des niveaux de DA et de dopamine transporter (DAT) fonctionnalité5. Lors d’enquêtes sur le système de DA, la possibilité de mesurer de manière fiable des taux endogènes de DA du cerveau adulte est essentielle. Par conséquent, nous présentons comment effectuer la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) sur les tissus cérébraux de souris pour déterminer les niveaux de l’AA. Nous effectuons l’expérience sur le tissu du striatum dorsal (dStr) et le noyau accumbens (NAc), mais la méthode convient également pour d’autres zones du cerveau DA-innervés.
DAT est essentiel pour le recaptage de la DA dans la terminaison présynaptique, contrôlant ainsi l’activité spatiale et temporelle de l’AA publié. Connaître les niveaux et les fonctionnalités de DAT dans le striatum est d’une importance majeure lors de l’évaluation de l’homéostasie du DA. Ici, nous fournissons un protocole qui permet de déduire simultanément des informations sur les niveaux de surface et fonction à l’aide d’un test d’absorption de synaptosomes6 DA.
Les méthodes actuelles combinées avec des protocoles standard immunoblotting fournissent le chercheur avec des outils pertinents pour caractériser le système DAergic.
Introduction
La dopamine (DA) est un neurotransmetteur modulatrice critique pour comportement moteur, de récompense et de la fonction cognitive1,7,8,9. Les déséquilibres dans l’homéostasie de la DA sont impliqués dans plusieurs maladies neuropsychiatriques tels que le trouble d’hyperactivité avec déficit de l’attention, la toxicomanie, la dépression et la maladie de Parkinson,1. DA est libéré du neurone présynaptique dans la fente synaptique, où il se lie à et active les récepteurs sur la membrane pre- et post-synaptiques, véhiculant ainsi davantage le signal. Le niveau de DA dans la synapse, après que la libération est spatialement et temporellement contrôlée par DAT3,10. Le transporteur séquestre DA de l’espace extracellulaire et soutient donc physiologique DA niveaux3,11. Suppression génétique des DAT chez la souris provoque un phénotype hyperdopaminergique caractérisé par des niveaux élevés de DA synaptiques, épuisement des réserves intracellulaires de DA et des changements profonds en postsynaptique DAergic signalisation10,12.
Ici, deux protocoles distincts sont présentés, une méthode pour la teneur en tissu mesure DA et un autre pour évaluer la fonctionnalité de DAT. combiné avec le test de surface biotinylation décrit par Gabriel et coll.13 ces deux méthodes renseignent sur DA contenu et fonctionnelles niveaux de DAT pour une évaluation approfondie de l’homéostasie de la DA. Avec ces méthodes DA l’homéostasie des diverses souris transgéniques ou des modèles de maladies peut être caractérisé et décrit. Ces outils ont été mis en place et optimisés et sont utilisation standard dans nos laboratoires. Les tests actuellement ont servi à étudier les conséquences sur l’homéostasie DA pourrait modifier le C-terminal de DAT14 ou exprimant une recombinase Cre en vertu de la tyrosine hydroxylase (TH) promoteur 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce manuscrit décrit les protocoles expérimentaux utiles pour délimiter l’homéostasie DA dans n’importe quel modèle de souris de choix. Nous fournissons des protocoles détaillés pour mesurant les niveaux de DA dans le tissu de cerveau de souris HPLC et la captation de DA pour évaluer fonctionnelle DA transport par le biais de DAT. Les procédures, les protocoles et les limites pour l’expérience HPLC et dosage de captation synaptosomes DA seront précisés ci-dessous.
Le protocole…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l’UCPH 2016 programme d’Excellence (UG, A.R., K.J.), la Fondation de Lundbeck (M.R.) la Fondation Lundbeck Center for Biomembranes en nanomédecine (UG), le National Institute of santé subventions P01 DA 12408 (UG), le danois Conseil pour la recherche indépendante – Sciences médicales (UG).
Materials
| COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| [3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
| Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
| Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
| Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
| LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
| Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
| Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
| Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
| Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
| Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
| Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
| Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
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