Valutazione dell'omeostasi dopaminergici in topi tramite l'uso di analisi di cromatografia liquida ad alte prestazioni e assorbimento della dopamina sinaptosomiali
Summary
Assorbimento della dopamina sinaptosomiali e strumenti sperimentali rappresentano di analisi di cromatografia liquida ad alte prestazioni per indagare l’omeostasi della dopamina nei topi valutando la funzione del trasportatore della dopamina e livelli della dopamina in tessuto striatal, rispettivamente. Qui presentiamo i protocolli per misurare il contenuto di tessuto di dopamina e di valutare la funzionalità del trasportatore della dopamina.
Abstract
Dopamina (DA) è un neurotrasmettitore modulatory controllo attività motoria, i processi di ricompensa e funzione conoscitiva. Danno della neurotrasmissione dopaminergica (DAergic) è fortemente associato con diverse malattie del sistema nervoso centrale-collegata come morbo di Parkinson, disordine di iperattività di deficit di attenzione e farmaco dipendenza1,2 ,3,4. Delineare meccanismi di malattie riguardanti lo squilibrio DA è dipende criticamente su modelli animali di imitare gli aspetti delle malattie, e quindi sono importanti per fornire nuove conoscenze e terapeutiche possibili protocolli che valutano le parti specifiche di omeostasi DA obiettivi per queste malattie.
Qui, vi presentiamo due protocolli sperimentali utili che quando combinati forniscono una lettura funzionale del sistema DAergica in topi. I parametri biochimici e funzionali su DA omeostasi sono ottenuti attraverso la valutazione dei livelli di DA e della dopamina (DAT) trasportatore funzionalità5. Quando si esamina il sistema DA, la capacità di misurare in modo affidabile i livelli endogeni di DA del cervello adulto è essenziale. Pertanto, vi presentiamo come eseguire cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) sul tessuto cerebrale dai topi per determinare i livelli di DA. Eseguiamo l’esperimento sul tessuto da striato dorsale (dStr) e nucleo accumbens (NAc), ma il metodo è adatto per altre aree cerebrali innervati DA anche.
DAT è essenziale per la ricaptazione della DA nel terminale presinaptico, controllando così l’attività temporale e spaziale di DA. rilasciato Nel valutare l’omeostasi DA conoscere i livelli e funzionalità di DAT nello striato è di grande importanza. Qui, forniamo un protocollo che consente contemporaneamente dedurre informazioni sui livelli di superficie e funzione usando un’analisi di assorbimento sinaptosomiale6 DA.
Attuali metodi combinati con protocolli standard immunoblotting forniscono il ricercatore con opportuni strumenti per caratterizzare il sistema DAergica.
Introduction
Dopamina (DA) è un neurotrasmettitore modulatory critico per il comportamento del motore, la ricompensa e la funzione conoscitiva1,7,8,9. Squilibri nell’omeostasi DA sono implicati in diverse patologie neuropsichiatriche come disordine di iperattività di deficit di attenzione, tossicodipendenza, depressione e morbo di Parkinson1. DA viene rilasciato dal neurone presinaptico nella fessura sinaptica, dove lega a ed attiva i recettori sulla membrana pre- e postsinaptico, trasporto così ulteriormente il segnale. Il livello di DA nella sinapsi dopo il rilascio è controllato da DAT3,10, spazialmente e temporalmente. Il trasportatore sequestra dallo spazio extracellulare e così sostiene la fisiologica DA livelli3,11. Rimozione genetica di DAT nei topi provoca un fenotipo di hyperdopaminergic caratterizzato dai livelli elevati DA sinaptica, deplezione intracellulare DA piscine e profondi cambiamenti nella postsinaptica DAergica segnalazione10,12.
Qui, vengono presentati due protocolli separati, un metodo di misura DA contenuto del tessuto e l’altro per valutare la funzionalità del DAT. combinata con l’analisi di superficie biotinylation descritto da Gabriel et al.13 questi due metodi forniscono informazioni su DA livelli di contenuto e funzionali di DAT per una valutazione approfondita dell’omeostasi DA. Con questi metodi DA omeostasi dei vari modelli di malattia o topi transgenici può essere caratterizzato e descritto. Questi strumenti sono stati implementati e ottimizzati e sono uso standard nei nostri laboratori. Saggi di corrente hanno servito per studiare le conseguenze sull’omeostasi DA alterare il C-terminale di DAT14 o esprimendo la Cre ricombinasi sotto la tirosina idrossilasi (TH) promotore 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo manoscritto descrive i protocolli sperimentali utili per delineare DA omeostasi in qualsiasi modello del mouse di scelta. Forniamo protocolli dettagliati per misura i livelli di DA nel tessuto cerebrale da topi con HPLC e sinaptosomiali DA assorbimento per valutare funzionale DA trasporto attraverso DAT. Saranno elaborati le procedure, protocolli e i limiti per l’esperimento di HPLC e analisi di assorbimento sinaptosomiale DA sotto.
Il protocollo di assorbimento sinaptosomiale in grado …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla UCPH 2016 programma d’eccellenza (U.G., A.R., K.J.), la Fondazione di Lundbeck (M.R.) la Fondazione Lundbeck Center for biomembrane in nanomedicina (U.G.), l’Istituto nazionale di salute sovvenzioni P01 DA 12408 (U.G.), danese Consiglio per la ricerca indipendente – scienze mediche (U.G.).
Materials
| COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| [3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
| Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
| Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
| Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
| LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
| Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
| Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
| Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
| Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
| Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
| Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
| Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
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