Generatie van het Model van een chronische obstructieve longziekte in muizen door herhaalde ozon blootstelling

Summary

Deze studie beschrijft de succesvolle generatie voor een nieuwe diermodel van chronische obstructieve longziekte (COPD) door muizen aan hoge concentraties van ozon herhaaldelijk bloot te leggen.

Abstract

Chronische obstructieve longziekte (COPD) wordt gekenmerkt door aanhoudende luchtstroom beperking en Long parenchymal vernietigen. Het heeft een zeer hoge incidentie in populaties veroudering. De huidige conventionele therapieën voor COPD focus vooral op symptoom-aanpassen drugs; de ontwikkeling van nieuwe therapieën is dus dringend noodzakelijk. Gekwalificeerde diermodellen van COPD kunnen bijdragen aan het karakteriseren van de onderliggende mechanismen en kunnen worden gebruikt voor nieuwe drug screening. Huidige modellen van de COPD, zoals lipopolysaccharide (LPS) of de varkens Pancreas elastase (PPE)-geïnduceerde emfyseem model, genereren van COPD-achtige letsels in de longen en de luchtwegen, maar doen niet anders lijken op de pathogenese van menselijke COPD. Een sigarettenrook (CS)-geïnduceerde model blijft een van de populairste, omdat het niet alleen COPD-achtige letsels in de luchtwegen simuleert, maar het is ook gebaseerd op één van de belangrijkste gevaarlijke materialen die COPD veroorzaakt bij de mens. Echter beperken de tijdrovend en arbeidsintensief aspecten van het CS-geïnduceerde model drastisch de toepassing ervan in nieuwe drug screening. In deze studie werd gegenereerd we met succes een nieuw model van de COPD door muizen tot hoge niveaus van ozon bloot te leggen. Dit model het volgende aangetoond: 1) geforceerde expiratoire 25, 50 en 75/forced vital capaciteit van het volume daalde (FEV₂₅/FVC, FEV₅₀/FVC en FEV₇₅/FVC), met vermelding van de achteruitgang van de longfunctie; 2) uitgebreide Long longblaasjes met Long parenchymal vernietiging; 3) verminderde vermoeidheid tijd en afstand; en 4) verhoogd van ontsteking. Samen genomen, blijkt deze gegevens dat de ozonlaag blootstelling (OE) model een betrouwbare dierlijk model dat is vergelijkbaar met mensen omdat ozon overbelichting is één van de etiologische factoren van COPD. Bovendien, duurde het slechts 6-8 weken, gebaseerd op onze eerdere werk, een OE om model te maken, terwijl het 3 tot 12 maanden voor het opwekken van het model van sigarettenrook, die aangeeft dat de OE-model zou kunnen een goede keuze voor COPD onderzoek zijn vereist.

Introduction

Er wordt geschat dat COPD, emfyseem en chronische bronchitis, misschien wel de derde belangrijkste doodsoorzaak in de wereld in 2020^1,2. De potentiële incidentie van COPD in een populatie ouder dan 40 jaar wordt geschat op 12,7% bij mannen en 8,3% bij vrouwtjes binnen de komende 40 jaar³. Geen medicijnen zijn momenteel beschikbaar voor het omkeren van de progressieve verslechtering van COPD patiënten⁴. Betrouwbare diermodellen van COPD niet alleen eisen de nabootsing van de ziekte pathologisch proces maar ook vereisen een korte generatie periode. Huidige COPD-modellen, met inbegrip van de LP’s of een PPE-geïnduceerde model, kunnen veroorzaken emfyseem-achtige symptomen^5,6. Eenmalige toediening of een week-lange uitdaging van LPS of PPE muizen of ratten resulteert in duidelijke neutrophilia in de bronchoalveolar lavage vloeistof (BALF), verhogingen pro-inflammatoire mediatoren (b.v., TNF-α en IL-1β) in de BALF of serum, produceert Long parenchymal vernietiging, uitgebreide luchtruimten, en grenzen luchtstroom^5,6,7,8,9,10. Echter LPS of PPE zijn geen oorzaken van menselijke COPD en dus doen niet na te bootsen de pathologische proces¹¹. Een CS-geïnduceerde model geproduceerd een persistente luchtstroom beperking, Long parenchymal vernietiging en verminderde functionele oefening capaciteit. Een traditionele CS-protocol vereist echter ten minste 3 maanden voor het genereren van een COPD model^12,13,14,15. Het is dus belangrijk voor het genereren van een nieuwe, efficiëntere diermodel die voldoet aan de twee eisen.

Onlangs, naast het roken van sigaretten, luchtverontreiniging en beroepsmatige blootstelling meer voorkomende oorzaken van COPD^16,17,18zijn geworden. Ozon, als een van de belangrijkste verontreinigende stoffen (hoewel niet de belangrijkste component van luchtverontreiniging) kan direct reageren met de luchtwegen en beschadiging van het longweefsel voor zowel kinderen en jonge volwassenen^{19,20,21 ,22,23,24,25}. Ozon, evenals andere stimulatoren waaronder LPS, PPE en CS, zijn betrokken in een ernstig van biochemische pathways van pulmonaire oxidatieve stress en DNA-beschadiging en zijn gekoppeld aan de inleiding en de bevordering van COPD^26,27. Een andere factor is dat de symptomen van sommige COPD-patiënten verslechteren na wordt blootgesteld aan ozon, die aangeeft dat ozon Long functie^18,28,29kan verstoren. Dus, we een nieuw model van de COPD gegenereerd door herhaaldelijk bloot muizen aan hoge concentraties van ozon voor 7 weken; Dit resulteerde in de luchtstroom gebreken en longschade parenchymal lijken op die van eerdere onderzoeken^30,31,32. Wij uitgebreid het OE-protocol tot vrouwelijke muizen in deze studie en gereproduceerd met succes de emfyseem waargenomen bij mannelijke muizen in onze eerdere studies^30,31,–³². Omdat COPD sterfte gedaald bij mannen maar verhoogd bij vrouwen in vele landen³³, een COPD-model bij vrouwtjes is nodig om te studeren van de mechanismen en methoden te ontwikkelen therapeutische voor vrouwelijke COPD patiënten. De toepasbaarheid van het model van de OE voor alle geslachten leent verdere steun aan het gebruik ervan als een COPD-model.

Protocol

Opmerking: de OE-model heeft zijn gegenereerd en gebruikt in reeds gerapporteerde onderzoek 30 , 31 , 32. Alle dierproeven werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van Shanghai Jiaotong University. 1. muizen huis pathogenen vrije, 7 – tot 9-week-oude vrouwelijke BALB/c muizen in individuele geventileerde kooien in een dier faciliteit onder gecontr…

Representative Results

Voorbeelden van 3D µCT beelden van elke groep worden weergegeven in Figuur 1een. De ozon-blootgesteld muizen had een aanzienlijk grotere totale Long volume (Figuur 1een en b) en LAA % (Figuur 1c) dan deed de muizen controle lucht-blootgesteld. Het volume van de longen en de LAA % bleef verhoogde na zes weken van ozon blootstelling3…

Discussion

In deze studie presenteren we een betrouwbare methode voor het genereren van een nieuw model van COPD. In vergelijking met andere modellen (dat wil zeggen, LP’s of modellen beschermingsmiddelen), recapituleert dit model OE de pathologische proces van COPD patiënten. Omdat sigarettenrook het belangrijkste gevaarlijke materiaal dat ervoor zorgt dat COPD in menselijke patiënten^{40 is}, blijft het CS-model de meest populaire COPD model^41,42…

Materials

BALB/c mice	Slac Laboratory Animal,Shanghai, China	N/A	7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study.
Individual ventilated cages	Suhang, Shanghai, China	Model Number: MU64S7	The cages were used for housing mice in the animal facility.
Sealing perspex-box	Suhang, Shanghai, China	N/A	The box was used  to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box.
Electric generator	Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany	Model 500	The device was used for generating ozone.
Ozone probe	ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK	Ozone 300	The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone.
Pelltobarbitalum natricum	Sigma, St. Louis, MO, USA	P3761	Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum.
Micro-Computed Tomography	GE Healthcare, London, ON, Canada	RS0800639-0075	This device was used for acquiring images of the lung.
Micro-view 2.01 ABA software	GE Healthcare, London, ON, Canada	Micro-view 2.01	This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung.
Treadmill machine	Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China	DSPT-208	This machine was usd for fatigue test.
Body plethysmograph	eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK	Forced Manoeuvres System	This device was used to test spirometry pulmonary function.
Ventilator	eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK	Forced Manoeuvres System	This device was used to test spirometry pulmonary function.
Slide spinner centrifuge	Denville Scientific, Holliston, MA, USA	C1183	It was used to spin BALF cells onto slides.
Wright Staining	Hanhong, Shanghai, China	RE04000054	It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF.
Hemocytometer	Hausser Scientific, Horsham, PA, USA	4000	It was used to count cells.
IL-1β	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab100704	They were used to test the respective factors in serum.
IL-10	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab46103	They were used to test the respective factors in serum.
TNF-α	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab100747	They were used to test the respective factors in serum.
Paraformaldehyde	Sigma, St. Louis, MO, USA	P6148	The lung was inflated by 4% paraformaldehyde.
Paraffin	Hualing, Shanghai, China	56#	It was used to embed the lung.
Rotary Microtome	Leica, Wetzlar,  Hesse, Germany	RM2255	It was used for sectioning the lung.
Hgaematoxylin and Eosin (H&E) staining solution	Solarbio, Beijing, China	G1120	H&E staining was done for morphometric analysis.
Upright bright field microscope	Olympus, Center Valley, PA, USA	CX41	It was used to image the H&E staining slides.
Adobe Photoshop 12	Adobe, San Jose, CA, USA	Adobe Photoshop 12	It was used to count the number of alveoli on the H&E stained images.
GraphPad prism 5	Graphpad Software Inc., San Diego, CA	GraphPad prism 5	It was used for data analysis and production of figures.