Geração de um modelo de doença pulmonar obstrutiva crônica em ratos pela exposição repetida de ozônio

Summary

Este estudo descreve a geração bem sucedida de um novo modelo animal de doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), repetidamente expondo ratos a concentrações elevadas de ozono.

Abstract

Doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é caracterizada pela destruição parenquimatosa pulmonar e limitação de persistente do fluxo de ar. Tem uma incidência muito alta no envelhecimento das populações. As terapias convencionais atuais para DPOC foco principalmente no sintoma-drogas; assim, é urgente o desenvolvimento de novas terapias. Modelos animais qualificados de DPOC poderiam ajudar a caracterizar os mecanismos subjacentes e podem ser usados para o rastreio de drogas novas. Modelos atuais de DPOC, tais como lipopolissacarídeo (LPS) ou a elastase pancreática porcina (PPE)-modelo de enfisema induzido, gerar a DPOC, como lesões nos pulmões e vias aéreas mas não caso contrário se assemelham a patogênese da DPOC humana. Fumo um cigarro (CS)-modelo induzido continua a ser um dos mais populares porque não só simula DPOC-lesões no sistema respiratório, mas também é baseado em um dos principais materiais perigosos que causa a DPOC em seres humanos. No entanto, os aspectos demorados e trabalhosos do modelo CS-induzido limitam drasticamente sua aplicação na despistagem de drogas novas. Neste estudo, geramos com êxito um novo modelo de DPOC, expondo os ratos a altos níveis de ozônio. Este modelo demonstrou o seguinte: 1) diminuiu o volume expiratório forçado 25, 50 e 75/forçado capacidade vital (VEF₂₅observou, VEF₅₀observou e VEF₇₅observou), indicando a deterioração da função pulmonar; 2) alvéolos pulmonares alargada, com destruição parenquimatosa pulmonar; 3) redução do tempo de fadiga e distância; e 4) aumento da inflamação. Tomados em conjunto, estes dados demonstram que o modelo de exposição (OE) de ozônio é um modelo animal confiável que é semelhante aos seres humanos porque superexposição de ozônio é um dos fatores etiológicos da DPOC. Além disso, só demorou 6-8 semanas, com base no nosso trabalho anterior, para criar um modelo de OE, Considerando que requer 3-12 meses para induzir o modelo de fumaça de cigarro, indicando que o modelo de OE pode ser uma boa escolha para a investigação de DPOC.

Introduction

Estima-se que a DPOC, incluindo enfisema e bronquite crônica, pode ser a terceira principal causa de morte no mundo em 2020^1,2. A potencial incidência de DPOC em uma população de mais de 40 anos de idade é estimada em 12,7% no sexo masculino e 8,3% nas fêmeas dentro os próximos 40 anos³. Não há medicamentos dispõem reverter a deterioração progressiva em pacientes de DPOC⁴. Modelos animais confiáveis de DPOC não só exigem a imitação do processo patológico da doença mas também requerem um período curto de geração. Modelos atuais de DPOC, incluindo os LPS ou um modelo de EPI-induzida, podem induzir sintomas de enfisema, como^5,6. Uma única administração ou um desafio da semana de LPS ou PPE ratos ou ratos resulta em neutrofilia marcada no líquido de lavagem broncoalveolar (LBA), aumentos de mediadores pró-inflamatórios (por exemplo, TNF-α e IL-1 β) no LBA ou soro, produz o pulmão espaços de ar parenquimatosos destruição-ampliado e limites do fluxo de ar^5,6,7,8,9,10. No entanto, LPS ou PPE não são causas de DPOC humana e, portanto, não imitar o processo patológico¹¹. Um modelo CS-induzido produziu uma limitação do fluxo de ar persistente, destruição parenquimatosa pulmonar e reduzida capacidade de exercício funcional. No entanto, um protocolo de CS tradicional requer pelo menos 3 meses para gerar um modelo do DPOC^12,13,14,15. Assim, é importante gerar um novo modelo animal mais eficiente que atenda os dois requisitos.

Recentemente, além de fumar de cigarro, poluição do ar e exposição ocupacional tornaram-se as causas mais comuns de DPOC^16,17,18. O ozônio, como um dos principais poluentes (embora não é o principal componente da poluição do ar), diretamente pode reagir com o trato respiratório e danificar o tecido pulmonar de crianças e jovens adultos^{19,20,21 ,22,23,24,25}. Ozônio, bem como outros estimuladores incluindo LPS, PPE e CS, estão envolvidos em uma séria de caminhos bioquímicos de estresse oxidativo pulmonar e danos ao DNA e estão ligados ao início e à promoção da DPOC^26,27. Outro fator é que os sintomas de alguns doentes com DPOC deteriorar-se após ser exposto ao ozônio, indicando que o ozônio pode interromper pulmão função^18,28,29. Portanto, geramos um novo modelo de DPOC, repetidamente, expondo ratos a concentrações elevadas de ozono por 7 semanas; Isto resultou em fluxo de ar defeitos e danos pulmonares parenquimatosas semelhantes de investigações anteriores^30,31,32. Nós estendido o protocolo de OE para ratos fêmeas neste estudo e reproduzido com sucesso o enfisema observado em ratos masculinos em nossos anteriores estudos^30,31,32. Porque a mortalidade da DPOC diminuiu em homens mas aumentou nas mulheres em muitos países,³³, um modelo de DPOC em fêmeas é necessário para estudar os mecanismos e desenvolver métodos terapêuticos para pacientes de DPOC. A aplicabilidade do modelo para todos os gêneros OE presta apoio adicional ao seu uso como um modelo de DPOC.

Protocol

Nota: OE o modelo foi gerado e usado em pesquisa anteriormente relatados 30 , 31 , 32. Todas as experiências com animais foram aprovadas pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) da Universidade de Shanghai Jiaotong. 1. ratos instalação casa isentos de organismos patogénicos, de 7 a 9-semana-idade BALB/c ratos fêmeas em gaiolas individuais ventilados um animal sob …

Representative Results

Exemplos de imagens 3D µCT de cada grupo são exibidos na Figura 1um. Os ratos expostos de ozônio tinham um volume de pulmão total significativamente maior (Figura 1a e b) e LAA % (Figura 1c) do que os ratos controle expostas ao ar. O volume pulmonar e LAA % manteve-se elevado após seis semanas de ozônio exposição31<sup…

Discussion

Neste estudo, apresentamos um método confiável para a geração de um novo modelo de DPOC. Comparado a outros modelos (i.e., LPS ou modelos de EPI), este modelo de OE recapitula o processo patológico de doentes com DPOC. Porque a fumaça do cigarro é o principal material perigoso que causa a DPOC em pacientes humanos⁴⁰, o modelo CS continua a ser o mais popular DPOC modelo^41,42. No entanto, o modelo CS requer um R de 3 a 12 me…

Materials

BALB/c mice	Slac Laboratory Animal,Shanghai, China	N/A	7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study.
Individual ventilated cages	Suhang, Shanghai, China	Model Number: MU64S7	The cages were used for housing mice in the animal facility.
Sealing perspex-box	Suhang, Shanghai, China	N/A	The box was used  to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box.
Electric generator	Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany	Model 500	The device was used for generating ozone.
Ozone probe	ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK	Ozone 300	The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone.
Pelltobarbitalum natricum	Sigma, St. Louis, MO, USA	P3761	Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum.
Micro-Computed Tomography	GE Healthcare, London, ON, Canada	RS0800639-0075	This device was used for acquiring images of the lung.
Micro-view 2.01 ABA software	GE Healthcare, London, ON, Canada	Micro-view 2.01	This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung.
Treadmill machine	Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China	DSPT-208	This machine was usd for fatigue test.
Body plethysmograph	eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK	Forced Manoeuvres System	This device was used to test spirometry pulmonary function.
Ventilator	eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK	Forced Manoeuvres System	This device was used to test spirometry pulmonary function.
Slide spinner centrifuge	Denville Scientific, Holliston, MA, USA	C1183	It was used to spin BALF cells onto slides.
Wright Staining	Hanhong, Shanghai, China	RE04000054	It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF.
Hemocytometer	Hausser Scientific, Horsham, PA, USA	4000	It was used to count cells.
IL-1β	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab100704	They were used to test the respective factors in serum.
IL-10	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab46103	They were used to test the respective factors in serum.
TNF-α	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab100747	They were used to test the respective factors in serum.
Paraformaldehyde	Sigma, St. Louis, MO, USA	P6148	The lung was inflated by 4% paraformaldehyde.
Paraffin	Hualing, Shanghai, China	56#	It was used to embed the lung.
Rotary Microtome	Leica, Wetzlar,  Hesse, Germany	RM2255	It was used for sectioning the lung.
Hgaematoxylin and Eosin (H&E) staining solution	Solarbio, Beijing, China	G1120	H&E staining was done for morphometric analysis.
Upright bright field microscope	Olympus, Center Valley, PA, USA	CX41	It was used to image the H&E staining slides.
Adobe Photoshop 12	Adobe, San Jose, CA, USA	Adobe Photoshop 12	It was used to count the number of alveoli on the H&E stained images.
GraphPad prism 5	Graphpad Software Inc., San Diego, CA	GraphPad prism 5	It was used for data analysis and production of figures.