Le c. elegans intestin comme un modèle intercellulaires Lumen morphogenèse et In Vivo polarisé la biogenèse membranaire au niveau unicellulaire : marquage par des anticorps, RNAi perte de fonction analyse et imagerie
Summary
Le transparent c. elegans intestin peut servir comme une «en vivo tissu chambre » pour l’étude des apicobasal la biogenèse membranaire et lumen au niveau unicellulaire et subcellulaire pendant tubulogenèse multicellulaires. Ce protocole décrit comment combiner un étiquetage standard, perte de fonction génétique/ARNi et approches microscopiques de disséquer ces processus au niveau moléculaire.
Abstract
Multicellulaires tubes, unités fondamentales des organes internes, sont composées de cellules épithéliales ou endothéliales polarisées, avec membranes apicales tapissant les membranes lumen et basolatérale communiquant avec eux et avec la matrice extracellulaire. Comment cette asymétrie membranaire distinctif est créée et maintenue au cours de la morphogenèse de l’orgue est encore une question non résolue de la biologie cellulaire. Ce protocole décrit l’intestin de c. elegans comme un modèle pour l’analyse de la biogenèse membranaire polarisée au cours de la morphogenèse de tube, en mettant l’accent sur la biogenèse membranaire et lumen apicale. Le c. elegans vingt-cellule seule couche épithélium intestinal est organisé dans un simple tube bilatéralement symétrique, permettant l’analyse sur le plan de cellule unique. Polarisation de la membrane se produit simultanément avec la division cellulaire polarisée et migrations au cours de l’embryogenèse précoce, mais en reprenant polarisé biogenèse membranaire se poursuit tout au long de la croissance larvaire, lorsque les cellules ne prolifèrent et se déplacent. Le dernier paramètre permet de séparer subcellulaires changements qui interviennent simultanément ces différents processus polarisants, difficiles à distinguer dans la plupart des modèles de polarité. Apical-basolatérale membrane-jonctionnelle-, du cytosquelette- et endomembranaire composants peuvent être marqués et suivis tout au long de l’élaboration des protéines de fusion de GFP ou évaluées par in situ anticorps coloration. Avec polyvalence génétique de l’organisme, l’intestin de c. elegans fournit donc un modèle unique en vivo pour le visuel, le perfectionnement et analyse en génétique moléculaire de membrane polarisée et tube biogenèse. Les méthodes spécifiques (tout norme) décrits ici comprennent comment : étiqueter des composants subcellulaires intestinales par anticorps coloration ; analyser les gènes impliqués dans la biogenèse membranaire polarisée par perte de fonction des études adaptés aux gènes essentiels généralement tubulogenèse ; évaluer les défauts de polarité au cours des différentes étapes du développement ; interpréter les phénotypes par épifluorescence, contraste interférentiel différentiel (DIC) et microscopie confocale ; quantifier les défauts visuels. Ce protocole peut être adapté pour analyser des molécules souvent hautement conservées impliquées dans la polarité épithéliale, biogenèse membranaire, morphogenèse tube et lumen.
Introduction
La génération des asymétries cellulaires et subcellulaires, tels que la formation de domaines membranaires polarisée, est cruciale pour la morphogénèse et la fonction des cellules, tissus et organes1. Études sur la biogenèse membranaire polarisée dans l’épithélium restent un défi technique, étant donné que les changements de direction dans la répartition des composants subcellulaires dépendent consécutives et coïncidant extracellulaires et intracellulaires des signaux multiples qui sont difficiles à séparer dans la plupart des modèles et dépendent fortement du système de modèle. Le modèle présenté ici – la seule couche Caenorhabditis elegans intestin – est un tissu d’une simplicité exquise. Ensemble avec la cellule unique canal c. elegans excréteur (voir document d’accompagnement sur la biogenèse membranaire polarisée dans le canal excréteur de c. elegans )2, il offre plusieurs avantages uniques pour l’identification et caractérisation des molécules nécessaires à la biogenèse membranaire polarisée. La conservation des repères de polarité moléculaire de la levure à l’homme de faire cet simple organe d’invertébrés un excellent «en vivo tissu chambre » pour répondre aux questions sur la polarité épithéliale qui se rapportent directement au système humain, qui est encore beaucoup trop complexe pour permettre la dissection visuelle de ces événements à l’unique cellule niveau in vivo.
Bien que plusieurs repères de polarité conservée de (1) la matrice extracellulaire (2) la membrane plasmique et les jonctions et le trafic vésiculaire (3) intracellulaire ont été identifiés3, les principes qui sous-tendent leur intégration dans le processus de polarisée biogenèse membranaire et tissu épithéliale est mal compris4. Les modèles classiques unicellulaires en vivo (e.g.S. cerevisiae et le zygote de c. elegans ) ont joué un rôle important dans la définition des principes de la division cellulaire polarisée et de polarité antéro-postérieur et ont identifié critiques polarité associée à la membrane déterminants (les petites GTPases/CDC-42, les PARs présentant un défaut de partitionnement)5,6, mais ils dépendent de la symétrie unique cues (cicatrice de bourgeon, entrée de sperme) et n’ont pas sécurisé par jonction apicobasal membrane domaines et, vraisemblablement, le correspondant apicobasal intracellulaire, machines de tri. Nos connaissances actuelles sur l’organisation du trafic polarisée dans l’épithélium, cependant, repose essentiellement sur des monocultures 2D mammifères7, qui n’ont pas des indicateurs physiologiques extracellulaires et développement qui peuvent changer de position de la membrane domaines et les directions des trajectoires de trafic (passage de la 2D à la 3D en vitro systèmes de culture seuls suffit pour inverser la polarité de la membrane des cellules MDCK (Madin-Darby canine kidney))8. In vivo du développement sur la polarité épithéliale chez les organismes invertébrés modèle a été initialement étudié dans l’épithélium plat, par exemple dans l’épiderme de Drosophila melanogaster , où ils ont identifié la contribution critique de la dynamique de la jonction pour la migration cellulaire polarisée et cellule feuille mouvement9et d’endocytose traite à polarité entretien10. La 3D in vitro et in vivo l’analyse de la morphogénèse de la lumière dans l’épithélium tubulaire dans les cellules MDCK et dans l’intestin de c. elegans , respectivement, ont récemment identifié l’exigence du trafic intracellulaire pour de Novo domaine (apical) et biogenèse lumen et positionnement11,12,13. L’épaisseur de tubulaire (par opposition à plat) des cellules épithéliales est un avantage pour l’analyse 3D des asymétries subcellulaires puisqu’elle permet une distinction visuelle supérieure de la membrane apicale-lumière, jonctions apico-latéral, la membrane latérale et le position des organites intracellulaires. À ces avantages visuels, le modèle de c. elegans ajoute le paramètre in vivo , transparence, axe du développement, simplicité du plan du corps, lignée de cellules invariant et définies, analytique (génétique) et des avantages supplémentaires décrits ci-dessous.
C. elegans lui-même est un ver rond de structure tubulaire dont la transparence et architecture simple faire ses organes internes de même tubulaires directement accessible à l’analyse visuelle de la morphogénèse tube et lumen. Les vingt cellules de son intestin (21 ou 22 cellules parfois)14 sont issus d’une cellule unique ancêtre (E) et se développent à partir d’un double épaisseur de l’épithélium par une étape d’intercalation dans un tube à symétrie bilatérale de neuf anneaux INT (quatre cellules dans le premier anneau ; Figure 1 schéma)14,15,16. Analyse de lignage et tissus de l’intestin, initialement déterminé par optique Nomarski via des identités nucléaire17puis par microscopie de fluorescence par l’intermédiaire des membranes étiquetées, a fourni un aperçu critique de sa morphogénèse, dans particulier les exigences autonome-cellule et cellule-non autonome pour son directionnel des divisions cellulaires et les mouvements (par exemple, intercalation, asymétrie droite-gauche, rotation de tube antérieur et postérieur)14,18 . La spécification des cellules endodermiques précoce et le réseau de régulation de gène contrôlant le développement de cet organe clonale modèle sont bien caractérisés19,20. Ici, cependant, porte sur l’analyse de membrane polarisée et biogenèse lumen dans les cellules tubulaires et des asymétries intracellulaires d’endomembranes, les structures du cytosquelette et les organites qui accompagnent ce processus. L’analyse est facilitée par la simplicité de ce tube, où toutes les membranes apicales (sur ultrastructures distingué de microvillosités) face à la lumière et toutes les membranes basales face à la surface du tube extérieur, avec des membranes latérales communiquant avec l’autre, séparée de la membrane apicale de jonctions (schéma de laFigure 1 , voir les références (16,21) pour c. elegans-organisation spécifique de serré et éléments de jonction adherens). Biogénèse de la membrane apicale est donc coïncidant avec la morphogénèse de la lumière. En outre, la taille des cellules intestinales adultes – les plus grandes cellules de ce petit animal (à l’exception de la cellule excréteur) – la taille approximative d’une cellule de mammifère, permettant le suivi visuel in vivo des éléments subcellulaires, par exemple trajectoires de vésicules, qui est généralement tenté in vitro dans une boîte de Petri.
Dans le but de cette analyse cellulaire et subcellulaire, un étiquetage approprié est essentiel. Domaines d’intestinal endo – ou -membrane plasmique, jonctions, du cytosquelettestructures, les noyaux et les autres organites subcellulaires peuvent être visualisées par leurs composants moléculaires spécifiques d’étiquetage. Plusieurs de ces composants ont été caractérisés et continuer à découvrir (letableau 1 donne quelques exemples et fait référence aux ressources). Par exemple, diverses molécules qui distingue les compartiments tubulaires ou vésiculaires du système endomembranaire intestinale, l’ER à l’appareil de Golgi par l’intermédiaire de vésicules de Golgi-post à la membrane plasmique, ont été identifiés22. Les spécifiques protéines (ainsi que les lipides et les sucres) soit peuvent être étiquetés directement, ou indirectement via les protéines de liaison. Ce protocole met l’accent sur la souillure d’échantillons fixés, une des deux techniques de marquage standards in situ anticorps (voir le document ci-joint sur canal excréteur tubulogenèse pour obtenir une description des autres technique2 – en vivo étiquetage par l’intermédiaire de fusions de la protéine fluorescente – qui s’applique directement à l’intestin ; Tableau 2 donne des exemples des promoteurs d’intestin spécifique qui peuvent être utilisés pour piloter l’expression de ces protéines de fusion de l’intestin). Doubles ou multiples étiquetage avec deux approches, ou avec une combinaison de ces deux plus supplémentaires attaque chimique, permet une plus grande résolution visuelle approfondie et l’examen des changements spatiaux et temporels dans la co-localisation et recrutement particulier des molécules ou des composants subcellulaires (Figure 2). La fixation et coloration des procédures décrites dans cette préservation de soutien de protocole de la protéine fluorescente verte (GFP) étiquetage pendant les procédures d’immunohistochimie. Pour l’imagerie, principaux points de la détection et caractérisation des phénotypes via des procédures standards microscopiques (dissection et confocale microscopie en fluorescence) sont de tubulogenèse décrit ()Figure 3, 4). Il peuvent être étendus à une résolution plus élevée d’imagerie approches, pour l’instance superrésolution microscope microscopes et électronique (non décrit ici).
Des atouts majeurs de ce système sont la capacité d’analyser la polarité dans des cellules individuelles à différents stades de développement, de l’embryogenèse à la vie adulte. Par exemple, la membrane apicale domaine et lumen la biogenèse peut être suivie tout au long du développement à l’échelle de la cellule unique moyen de l’étiquetage avec MCE-1, un lieur de membrane-actine hautement conservée de la moésine-radixine-Ezrin famille23,24 . ERM-1 visualise la biogenèse (1) de la membrane apicale au cours de la morphogénèse du tube embryonnaires, lorsqu’elle se produit simultanément avec la division cellulaire polarisée et migration (déplacement de cellules apicalement autour de la lumière au cours de l’intercalation)15; (2) au cours de fin extension tube embryonnaire et larvaire qui se déroule en l’absence de division cellulaire ou de la migration ; et (3) dans l’intestin adulte, où les domaines membranaires polarisées sont entretenus (Figure 1). Dans l’épithélium larvaire post-mitotique en expansion, de novo polarisé membrane biogenèse se distingue ainsi de la morphogenèse tissu polarisée, qui n’est pas possible dans la plupart des modèles polarité épithéliale in vivo et in vitro , y compris ceux avec résolution monocellulaires (par exemple le 3D MDCK kyste modèle8). D’étiquetage pour les autres composants, ce paramètre fournit l’occasion (particulièrement dans le stade larvaire L1 lorsque les cellules ont un ratio plus élevé de cytoplasme/noyau) pour distinguer ces modifications intracellulaires spécifiques à polarisé (membrane) biogenèse par exemple la réorientation des trajectoires de trafic) de celles requises en même temps que la division cellulaire polarisée et la migration.
La polyvalence génétique de c. elegans est bien connu25et rend un système puissant de modèle pour l’analyse moléculaire de n’importe quelle question biologique. Une étude sur la morphogenèse, par exemple, peut commencer par une souche de type sauvage, une souche transgénique où la structure d’intérêt (par exemple une membrane) est marquée avec un marqueur fluorescent, ou avec un mutant perte ou gain de-fonction présentant un défaut dans ce structure. Une étude génétique inverse typique peut générer un mutant où le gène d’intérêt est supprimé dans la lignée germinale (p. ex. par une suppression ciblée), modifiée par mutagénèse (produisant généralement des mutations ponctuelles avec perte, réduction ou un gain en fonction du gène), ou si sa transcription est réduite d’Arni. La facilité de l’ARNi en se nourrissant dans c. elegans26 se prête également à la conception d’écrans ciblés qui examinent un plus grand groupe de gènes d’intérêt. Les sans doute plus grande force de l’organisme d’un modèle génétique sont la capacité à conduire en vivo avancer écrans (p. ex. mutagénèse, systématiques ou génome écrans RNAi) qui autorisent une enquête impartiale sur la cause moléculaire pour un phénotype de intérêt. Par exemple, un visual impartiale Arni c. elegans tubulogenèse écran, commençant par un animal transgénique avec membranes apicales MCE-1-étiqueté, découvert une conversion de polarité intestinal réversible intrigante et phénotype lumen ectopique, utilisé Voici un exemple pour ce type d’analyse. Cet écran identifié l’appauvrissement des glycosphingolipides (GSL ; lipides de la membrane obligatoires, identifiés par leurs enzymes biosynthétiques-GLS) et les composants de la clathrine coat de vésicule et son adaptateur AP-1 comme défauts moléculaires spécifiques causant cette polarité phénotype de la conversion, caractérisant ainsi ces molécules le trafic comme in vivo cues pour la polarité de la membrane apicale et lumen positionnement12,13. Lorsque vous démarrez avec un phénotype spécifique mutation génétique/morphogenèse, ces écrans (ou des expériences unique interaction génétique/ARNi) peuvent également examiner les interactions fonctionnelles entre deux ou plusieurs gènes d’intérêt (voir document d’accompagnement sur l’excrétion canal pour obtenir un exemple d’une telle analyse)2. Ce protocole met l’accent sur l’ARNi, qui, outre sa capacité d’identifier directement le gène dont la perte provoque le phénotype à avancer les écrans, offre des avantages spécifiques pour l’analyse de la morphogénèse. Étant donné que les produits des gènes dirigeant morphogenèse souvent travaillent d’une manière dose-dépendante, Arni est généralement couronnée de succès dans la production d’un éventail de phénotypes. La capacité de générer des phénotypes partielle-perte de fonction informatives permet également de régler le problème que la majorité des tubulogenèse importants gènes est essentielle et que leurs pertes causent la stérilité et la létalité embryonnaire précoce. Ce protocole comprend conditionnelle Arni stratégies pour surmonter cette difficulté et suggère des façons d’optimiser la production d’un plus large éventail de phénotypes, par exemple une série allélique produites par mutagénèse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit comment combiner standard perte de fonction génétique/ARNi et imagerie (étiquetage et microscopiques) approches afin de tirer parti de l’épithélium intestinal de c. elegans comme modèle pour le visuel et moléculaire dissection du in vivo la biogenèse membranaire et de la lumière polarisée.
L’étiquetage
Ce protocole met l’accent sur la coloration de l’anticorps. In situ , marquage par…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Mario de Bono (laboratoire de biologie moléculaire de MRC, Cambridge, UK), Kenneth J. Kemphues (Cornell University, Ithaca, États-Unis), Michel Labouesse (Institut de Biologie Paris Seine, Université Pierre et Marie Curie, Paris, France), Grégoire Michaux (Université deRennes 1, Rennes, France) et la CGC, financé par le NIH Bureau des programmes d’Infrastructure de recherche (P40 OD010440), pour les souches et les anticorps. Ce travail a été soutenu par subventions GM078653 NIH, HGM est 224570 et SAA 223809 à V.G.
Materials
| Antibody staining | |||
| poly-L-lysine | Sigma | P5899 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949SK-4 | |
| Tween | Fisher Scientific | 50-213-612 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Powdered milk | Sigma | MT409-1BTL | |
| Primary antibodies | |||
| MH27 (mouse) | Concentration: 1:20 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank. | ||
| MH33 (mouse) | Concentration: 1:10 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank. | ||
| anti-ICB4 (rabbit) | Concentration: 1:5 Resources: A gift from MariodeBono (Medical Research Council, England) | ||
| anti-PAR-3 (rabbit) | Concentration: 1:50 Resources: A gift from Kenneth J. Kemphues (Cornell University) | ||
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Floor 568 (anti-rabbit) | ABCam | AB175471 | Concentration: 1:200 |
| Cy5 (anti-mouse) | Life technologies | A10524 | Concentration: 1:200 |
| TRITC (anti-rabbit) | Invitrogen | T2769 | Concentration: 1:200 |
| FITC (anti-mouse) | Sigma | F9006 | Concentration: 1:100 |
| Labeled chemicals | |||
| Texas Red-Phalloidin | Concentration: 1:100 Resources: Molecular Probes-T7471 | ||
| Materials | |||
| Vacuum Grease Silicone | Beckman | 335148 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 4448 | |
| Microscope coverslips (22×22-1) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| C. elegans related | see reference29 for standardC. elegans culture and maintenance procedures. | ||
| LB Medium and plates | see reference29 for protocols. | ||
| Tryptone | Acros Organics | 611845000 | |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214040 | |
| Ampicillin | Sigma | A0116 | |
| Tetracycline | Fisher Scientific | BP912 | |
| M9 Medium | see reference29 for protocols. | ||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| MgSO4 | Sigma | M2773 | |
| NGM plates | see reference29 for protocols. | ||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Tryptone | Acros Organics | 611845000 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214040 | |
| MgSO4 | Sigma | M2773 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| Cholesterol | Sigma | C8667 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| RNAi plates | see reference30 for protocols. | ||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Tryptone | Acros Organics | 611845000 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214040 | |
| MgSO4 | Sigma | M2773 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| Cholesterol | Sigma | C8667 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| IPTG | US Biological | I8500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP2648 | |
| NaOH | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Sodium hypochlorite | Fisher Scientific | 50371500 | |
| Bacteria | |||
| OP50 bacteria | CGC | ||
| HT115 bacteria | CGC | ||
| Genome-wide RNAi libraries Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref 30,49,50) | Source BioScience | ||
| C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref51) | Source BioScience | ||
| Imaging related | |||
| Sodium azide | Fisher Scientific | BP9221-500 | |
| Equipment | |||
| dissecting microscope | Nikon | SMZ-U | |
| dissecting microscope equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions) | Olympus | SZX12 | |
| Laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystem | TCS SL | |
| laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope | Nikon | C2 |
Riferimenti
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