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Biologia dello sviluppo

O Canal de Excretory c. elegans como modelo para intracelular Lumen morfogênese e Vivo na biogênese de membrana polarizada em uma única célula: rotulagem por GFP-fusões, tela de interação de RNAi e Imaging

Published: October 03, 2017
doi:
10.3791/56101
, , , , ,
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital for Children,Harvard Medical School, 2College of Life Sciences,Jilin University, 3Faculty of Health Sciences,University of Macau

Summary

O canal excretor de c. elegans é um exclusivo modelo de célula única para a análise visual na vivo de biogênese de membrana de novo polarizada. Este protocolo descreve uma combinação de padrão genético/RNAi e abordagens, adaptávelas para a identificação e caracterização de moléculas dirigindo tubulogenesis unicelulares e apical da membrana e lúmen biogênese de imagem.

Abstract

Os quatro canais excretores de c. elegans são tubos estreitos estendidos através do comprimento do animal, de uma única célula, com quase igualmente longe estendido endotubes intracelular que construir e estabilizar o lúmen com uma membrana e submembraneous citoesqueleto de caráter apical. Excretor célula expande seu comprimento aproximadamente 2.000 vezes para gerar esses canais, fazendo com que este modelo exclusivo para a avaliação na vivo de biogênese de membrana de novo polarizada, morfogênese lúmen intracelular e unicelulares tubulogenesis. O protocolo apresentado aqui mostra como combinar o padrão de rotulagem, ganho e perda-de-função genética ou RNA de interferência (RNAi)-e abordagens microscópicas usar este modelo para dissecar visualmente e funcionalmente analisar esses processos em um nível molecular. Como um exemplo de uma abordagem de rotulagem, protocolo descreve a geração de animais transgénicos com proteínas da fusão fluorescente para análise ao vivo de tubulogenesis. Como um exemplo de uma abordagem genética, destaca pontos-chave de uma tela de interação baseada em RNAi visual projetado para modificar um fenótipo de ganho-de-função canal cístico. Os métodos específicos descritos são como: etiqueta e visualizar os canais expressando proteínas fluorescentes; construir uma biblioteca de alvo RNAi e strategize RNAi triagem para a análise molecular da morfogênese de canal; visualmente, avaliar as modificações dos fenótipos de canal; Pontuação deles dissecando a microscopia de fluorescência; caracterizar componentes subcelulares canal com resolução mais alta pela microscopia confocal; e quantificar parâmetros visuais. A abordagem é útil para o investigador que está interessado em aproveitar o canal excretor de c. elegans para identificar e caracterizar os genes envolvidos nos processos filogeneticamente conservados de lúmen intracelular e unicelulares morfogênese de tubo.

Introduction

Todos os órgãos internos são compostos de tubos, cruciais para suas muitas funções diferentes, tais como o transporte e a troca de gases, líquidos e nutrientes e a excreção de resíduos metabólicos. Seu caráter polarizado, com distintas membranas apicais e lumenal, é adaptado para essas funções específicas, e defeitos na biogênese dos seus sistemas de endo – e membrana plasmática são uma causa frequente de doença humana1,2. A maioria dos tubos da vasculatura e dos órgãos internos é pluricelulares e forma um lúmen intercellularly; no entanto, tubos unicelulares, que formam o lúmen intracelular, podem, por exemplo, representar tanto quanto 30 – 50% dos leitos de capilares humano2. As membranas polarizadas de multi – e tubos unicelulares são similares na composição, embora seus microdomains podem variar com base na função específica do tubo (por exemplo, canalículos canal excretor contra microvilli intestinal em Caenorhabditis elegans; Veja que acompanham o papel de c. elegans tubulogenesis intestinal)3. Os princípios da biogênese de membrana polarizada e tubulogenesis são conservados entre metazoários, e uma máquina molecular semelhante direciona-los1,2,4.

O sistema excretor de c. elegans consiste de cinco células: a célula excretor (CE), célula de duto (DC), pore celular (PC) e duas células da glândula. Ablação do CE, DC ou PC faz com que o acúmulo de líquido na cavidade do corpo e os animais morrem em um início de fase larval5. Curiosamente, estes três tubos unicelulares criar seus lúmens de três maneiras diferentes: por célula esvaziamento (CE); envolvimento de célula juntamente com formação de junção autocellular (PC); e pelo envolvimento da célula, juntamente com autofusion (DC); diferentes mecanismos da morfogênese lúmen que são todas conservadas filogeneticamente6,7. O CE, localizado na lateral esquerda do bulbo posterior da faringe, envia duas extensões laterais do que os quatro canais ramificam-se para estender-se anteriormente e posteriormente (ambos do lado direito e esquerdo) para a ponta do nariz do worm e cauda , respectivamente (Figura 1)5,6,8. O CE estende-se desde aproximadamente 1 µm a 2 x 1.000 µm, tornando-se a célula maior no animal. Em um nível subcelular, o canal excretor é um tubo simples, gerado a partir de uma membrana basal, dirigida para a Trochozoa e um túnel por uma membrana lumenal (endotube). A membrana lumenal canal conecta-se à membrana lumenal adesiva em sua junção só intercelular; os canais são outra forma junctionless ao longo de seu comprimento (Figura 1). A membrana lumenal canal excretor e sua submembraneous citoesqueleto são apicais, definido por sua composição molecular que se assemelha a composição da membrana apical e submembraneous citoesqueleto de tubos multicelulares, tais como o intestino, e de outros epitélios (por exemplo, plana). Organelas citoplasmáticas, incluindo CDDP vesicular e outro (por exemplo, Golgi) endomembranes são distribuídos ao longo do comprimento do canal. Além disso, várias vesículas canaliculares – ligado à membrana lumenal, e/ou interligados ou isolada – são rosqueadas através do canal citoplasma7,8,9,10 . Esta conexão de plasma-membrana/canaliculares dinâmico mais expande sistema de membrana do canal e contribui para ambos lúmen morfogênese e osmoregulação10. O canal excretor assim consiste quase inteiramente de endo – e membranas de plasma, proporcionando um excelente modelo para a análise de biogênese de membrana polarizada e o Regulamento do endo-a interface da membrana plasmática. A dramática expansão da membrana apical durante a morfogênese do canal – neste sistema de célula única coincidente com extensão de lúmen – também permite analisar os problemas arquitectónicos decorrentes da necessidade de estabilizar e centralizar uma membrana lumenal intracelular . Este protocolo centra-se na análise da morfogênese estrutural do tubo canal e do lúmen e a dinâmica da membrana intracelular necessária para este processo, em vez dos sinais que dirigem o movimento da célula que geram a posição da CE na sistema excretor e construir suas intrincadas conexões com outros elementos celulares (revistos em6).

Uma vantagem adicional do sistema de célula única canal c. elegans para a análise da membrana polarizada e biogênese intracelular lúmen é sua capacidade de separar, no tempo do desenvolvimento, a geração de diferentes componentes de suas membranas e entroncamentos. A CE é nascida no momento do encerramento ventral e resolve ventro-lateral da faringe durante meados embriogênese5,6,8, durante o qual a extensão de tempo canal lateral e ramificação ocorrerem. Isto é seguido pela extensão do canal ântero-posterior durante a embriogênese atrasado, um processo que continua para o estágio larval de L1 (Figura 1). Em uma larva recém-eclodidos, a ponta do canal posterior atinge aproximadamente no meio do worm, totalmente estendendo-se até a cauda no final da fase L1, após o que o canal se alonga juntamente com o worm8. Crescimento do canal ativo a uma velocidade superior do crescimento do animal assim termina a primeira fase larval, no entanto, ainda mais o crescimento ocorre em paralelo com o crescimento do animal inteiro durante os estágios larvas adicionais (L2 – 4). Essa configuração fornece a oportunidade de analisar as diferentes etapas da biogênese de membrana de novo polarizada independente da divisão de células polarizada ou migração. Além disso, permite a separação deste processo da Assembleia dos cruzamentos (que ocorrem no embrião antes do início do lúmen); sua exigência exata na polarização de membrana é ainda uma questão em aberto no campo de polaridade. Finalmente, excepcionalmente separa apical de expansão de membrana basal, o último processo precede o anterior nos canais excretores10. O modelo de canal excretor de c. elegans , portanto, é um complemento particularmente informativo para o modelo intestinal que compartilha um número dessas vantagens para a análise de biogênese de membrana polarizada, mas executa-lo em uma configuração multicelular (ver o livro acompanhando sobre a tubulogenesis intestinal3).

Embora o selvagem-tipo canais são túbulos ultrafinos neste pequeno verme, seus lúmens podem ser visualized diretamente pela óptica Nomarski neste animal transparente. Na verdade, morfologias mutante canal cístico podem ser caracterizadas em animais sem rótulo usando baixa ampliação dissecando microscopia, que tem sido usada com grande efeito nas telas de genéticas para a frente para identificar genes envolvidos na tubulogenesis11. Melhor visualização da morfologia dos canais e distinção de suas membranas polarizadas, componentes do citoesqueleto, diferentes organelas intracelulares e outras estruturas subcelulares, no entanto, exige a rotulagem e superior de energia fluorescente microscopia confocal e dissecação. Embora a estrutura de fina dos canais coloca uma série de dificuldades para a rotulagem e microscopia, membranas e componentes subcelulares podem ser distinguidos através das moléculas específicas exclusivas para cada compartimento, e animais podem ser montados com segurança para microscopia, por se certas precauções para evitar a introdução de artefatos (ver protocolo e discussão). Rotulagem pode ser feito por imuno-histoquímica em amostras fixas, ou através da geração de vermes transgênicos expressando proteínas da fusão fluorescente sob o controle de suas próprias ou excretoras promotores de canal específico para a imagem latente na vivo . Este protocolo descreve a última técnica de rotulagem (tubulogenesis intestinal para anticorpo que mancha3ver o papel de acompanhamento).

A habilidade de combinar estudos de perda ou ganho-de-função na vivo com na vivo de imagem análise na célula única nível ao longo do desenvolvimento faz o canal excretor de c. elegans um modelo particularmente forte para o molecular e análise celular de tubulogenesis unicelulares. Avanço ou retrocesso telas genéticas podem ser executadas iniciando com um animal transgénico selvagem-tipo ou etiquetado para identificar fenótipos de morfogênese de canal (por exemplo, cistos) e seus defeitos genéticos subjacentes. Alternativamente, tais telas podem começar com um fenótipo mutante (por exemplo, um canal cístico) e identificar supressores ou potenciadores deste fenótipo para identificar genes que interagem funcionalmente com o gene causando o fenótipo mutante. O defeito genético causando o fenótipo mutante pode induzir uma perda (por exemplo, através do apagamento do gene) ou um ganho (por exemplo, através de uma mutação de ativação ou através da introdução de cópias do gene em excesso) da função investigada. Encaminhar mutagênese ou RNAi sistemática telas são sem preconceitos em função dos genes e permitirem a identificação imparcial de genes envolvidos na função de interesse. Tendo em conta a disponibilidade de todo o genoma de RNAi alimentação bibliotecas, quase cada gene pode ser facilmente derrubado por RNAi em c. elegans, tal que qualquer único gene de interesse ou qualquer grupo de genes (por exemplo, em telas de alvo) pode também ser rapidamente analisado por seu efeito em uma abordagem genética reversa. Para demonstrar uma possível combinação de abordagens, aqui descrevemos uma tela de interação alvo RNAi, começando com um mutante de ganho-de-função cística canal excretor, rotulado com proteína de canal citoplasmática verde fluorescente (GFP). O fenótipo mutante foi gerado pela superexpressão de erm-1, um altamente conservadas c. elegans ortholog da família de vinculador de membrana-actina Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), que tem sido implicados na morfogênese do lúmen e membrana organização em muitas espécies12. C. elegans ERM-1 localiza-se às membranas lumenal dos órgãos internos, tais como o canal excretor e intestino e é necessário para a formação do lúmen em ambos13. MTC-1 superexpressão recrutas excesso actina e vesículas para a membrana lumenal canal, aumentando o fluxo no lúmen e gerando um curto canal cístico e uma membrana lumenal frisada com actina espessada subpêlo9. O protocolo descreve como gerar cepas transgênicas com canal excretor-expressa rotulado fusão proteínas (ou outras proteínas); como executar alvo RNAi telas começando com essas estirpes, para identificar os modificadores de um fenótipo de canal; e como analisar visualmente os resultados de tais telas por dissecação e confocal a microscopia de fluorescência, incluindo maneiras simples de quantificar fenótipos tubulogenesis informativo. Alternativa de rotulagem técnicas e detalhes de RNAi, ajustado para os genes tubulogenesis frequentemente letal, encontram-se no livro de acompanhamento sobre tubulogenesis intestinal3. Todos os métodos podem ser usados em várias combinações para a investigação de outras perguntas no canal tubulogenesis.

Protocol

1. rotulagem do c. elegans Excretory Canal por proteínas fluorescentes fusão 14 Nota: consulte o documento que acompanha na intestinal tubulogenesis 3 para a rotulagem pelo anticorpo em situ coloração procedimentos adaptáveis ao canal excretor. Consulte a tabela 1 para obter exemplos de moléculas provados útil para a visualização de c. elegans canal excretor endo – e membranas de plasma, <st…

Representative Results

Este protocolo descreve como usar os canais excretores de c. elegans visualmente e molecularmente analisar tubulogenesis unicelulares e morfogênese lúmen intracelular em uma única célula. Durante sua extensão da época do meio da embriogênese até a idade adulta, os quatro canais excretores continuam a expandir seus basolateral e apical/lumenal membranas juntamente com seu sistema endomembranoso canalicular e CDDP, fornecendo um modelo exclusivo para a análise na vivo<…

Discussion

Versatilidade genética dos c. elegans , transparência, plano de corpo simples e linhagem de células invariável fazem um excelente modelo para a análise da morfogênese. Este protocolo descreve como combinar padrão manipulações genéticas e a imagem latente estudos para aproveitar a 2 mícrons fina c. elegans canais excretores para estudar a membrana polarizada e biogênese intracelular lúmen em um tubo de célula única.

Rotulagem
C. elegans</…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a M. Buechner (Universidade de Kansas, Kansas, EUA), K. Nehrke (Universidade de Rochester Medical Center, Rochester, Nova Iorque, EUA) e o centro de genética Caenorhabditis , financiado pelo National Institutes of Health, escritório de infra-estruturas de investigação Programas (OD010440 P40). Este trabalho foi apoiado por subsídios GM078653 NIH, MGH é 224570 e 223809 de SAA a V.G.

Materials

Cloning
Plasmid pPD95.75 Addgene Cat. No. 37464
PCR Kit Qiagen Cat. No. 27106
Ligation kit New England Biolabs Cat. No. E2611L
DNA marker Thermo Scientific Cat. No. SM1331
Agarose DNA grade Fisher Scientific Cat. No. BP164-100
Competent cells New England Biolabs Cat. No. C2987H
Tris Fisher Scientific Cat. No. BP154-1
EDTA Sigma Cat. No. ED-1KG
Acetic acid Fisher Scientific Cat. No. A38S-500
Ethidium bromide Fisher Scientific Cat. No. BP1302-10
Equipments
PCR machine  MJ Research Cat. No. PTG-200 
Centrifuge Eppendorf  Cat. No. 5415C
Water Bath Precision Scientific  Cat. No. 666A3 
Gel running instrument Fisher Scientific Cat. No. 09-528-165
Gel running power supply Fisher Scientific Cat. No. 45-000-465
Molecular Imager Gel Doc XR System Bio-Rad Cat. No. 1708195EDU
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific Cat. No. ND1000
C. elegans related1 1see reference27 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates2 2see reference24 for protocols.
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Yeast Extract BD Biosciences Cat. no. 212750
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
Ampicillin Sigma Cat. no. A0116
Tetracycline Fisher Scientific Cat. no. BP912
M9 Medium2 2see reference24 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
Na2HPO4 Sigma Cat. no. S7907
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
NGM plates 2 2see reference24 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Peptone  BD Biosciences Cat. no. 211677
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
CaCl2 Sigma Cat. no. C3881
Cholesterol  Sigma Cat. no. C8667
K2HPO4  Sigma Cat. no. P3786
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
RNAi plates3 3see reference60 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Peptone  BD Biosciences Cat. no. 211677
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
CaCl2 Sigma Cat. no. C3881
Cholesterol  Sigma Cat. no. C8667
K2HPO4  Sigma Cat. no. P3786
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
IPTG  US Biological Cat. no. I8500
Carbenicillin Fisher Scientific Cat. no. BP2648
NaOH Fisher Scientific Cat. no. SS266-1
Sodium hypochlorite Fisher Scientific Cat. no. 50371500
Bacteria
OP50 bacteria CGC
HT115 bacteria CGC
Genome-wide RNAi libraries
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref29,49) Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref50) Source BioScience
Imaging related
Lidocaine MP Biomedicals,LLG Cat. no. 193917
Materials
Vacuum Grease Silicone Beckman Cat. no. 335148
Microscope slides  Fisher Scientific Cat. no. 4448
Microscope coverslips (22×22-1） Fisher Scientific Cat. no. 12-542-B
Tissue culture plate, 6 well  Corning Inc. Cat. no. 08-772-33
Equipment
SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)
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Riferimenti

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Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging. J. Vis. Exp. (128), e56101, doi:10.3791/56101 (2017).
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