JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia dello sviluppo

C. elegans Excretory kanalen som en modell för intracellulära Lumen morfogenes och In Vivo polariserade membran biogenes i en enda Cell: märkning av GFP-fusions, RNAi interaktion skärm och Imaging

Published: October 03, 2017
doi:
10.3791/56101
, , , , ,
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital for Children,Harvard Medical School, 2College of Life Sciences,Jilin University, 3Faculty of Health Sciences,University of Macau

Summary

C. elegans utsöndringsorganen kanalen är en unik single-cell modell för visuell i vivo analys av de novo polariserade membran biogenes. Det här protokollet beskriver en kombination av standard genetiska/RNAi och imaging metoder, anpassningsbar för identifiering och karakterisering av molekyler styra encelliga tubulogenesis och apikala membran och lumen biogenes.

Abstract

De fyra C. elegans utsöndringsorganen kanalerna är smala rör utvidgas genom längden på djuret från en enda cell, med nästan lika långt utökade intracellulära endotubes att bygga upp och stabilisera lumen med membran och submembraneous cytoskelettet apikala karaktär. Utsöndringsorganen cellen expanderar sin längd cirka 2.000 gånger för att generera dessa kanaler, vilket gör denna modell unika för i vivo bedömning av de novo polariserade membran biogenes, intracellulära lumen morfogenes och encelliga tubulogenesis. Det protokoll som presenteras här visar hur man kombinerar standard märkning, vinst – och förlust-av-funktion genetiska eller RNA-interferens (RNAi)-, och mikroskopiska metoder att använda denna modell att visuellt dissekera och funktionellt analysera dessa processer på molekylär nivå. Protokollet beskrivs som ett exempel på en märkning strategi, genereringen av transgena djur med fluorescerande fusionsproteinerna för levande analys av tubulogenesis. Som ett exempel på en genetisk metod belyser det viktiga punkter i en visuell RNAi-baserad interaktion skärm för att ändra en gain-of-function cystisk kanalen fenotyp. De särskilda metoder som beskrivs är hur man: etikett och visualisera kanalerna genom att uttrycka fluorescerande proteiner; konstruera ett riktade RNAi-bibliotek och upp strategier RNAi screening för molekylär analys av kanalen morfogenes; visuellt bedöma ändringar av kanalen fenotyper; Poäng dem genom att dissekera fluorescensmikroskopi; karakterisera subcellulär canal komponenter med högre upplösning av konfokalmikroskopi; och kvantifiera visuella parametrar. Metoden är användbar för utredaren som är intresserade i att utnyttja C. elegans utsöndringsorganen kanalen för att identifiera och karaktärisera gener inblandade i fylogenetiskt konserverade processer av intracellulära lumen och encelliga Tube morfogenes.

Introduction

Alla inre organ består av rör, avgörande för deras många olika funktioner, såsom transport och utbyte av gaser, vätskor och näringsämnen samt utsöndring av metabola avfall. Deras polariserade karaktär, med distinkta apikala och lumenal membran, är anpassad till dessa specifika funktioner och brister i biogenes av deras endo- och plasmamembranet system är en vanlig orsak till mänskliga sjukdomar1,2. Majoriteten av rören i kärlsystemet och inre organ är flercelliga och bildar en lumen intercellularly; dock kan, encelliga rör, som bilda lumen intracellulärt, exempelvis representerar så mycket som 30 – 50% av mänskliga kapillära sängar2. De polariserade membran av multi – encelliga rör har liknande sammansättning, även om deras microdomains kan variera beroende på rörets specifik funktion (t.ex., det utsöndringsorganen canal canaliculi kontra intestinal Mikrovilli i Caenorhabditis elegans; Se medföljande papper på C. elegans intestinal tubulogenesis)3. Principerna om polariserade membran biogenes och tubulogenesis bevaras bland metazoans, och en liknande molekylära maskineri dirigerar dem1,2,4.

C. elegans utsöndringar systemet består av fem celler: utsöndringsorganen cellen (EG), kanal-cellen (DC), pore cell (PC) och två körtelceller. Ablation av EG, DC eller PC orsakar vätskeansamling i kroppen hålighet och djur dö på en tidig larvstadium5. Spännande, dessa tre encelliga rör skapa deras lumen på tre olika sätt: genom cell urholkningen (EG); cell omslag tillsammans med autocellular junction bildandet (PC); och av cell omslag tillsammans med autofusion (DC); olika mekanismer av lumen morfogenes som är alla fylogenetiskt konserverade6,7. EG, ligger på den vänstra laterala sidan av den bakre svalget glödlampan, skickar ut två laterala tillägg från som de fyra kanalerna filial ut för att utöka anteriorly och posteriort (på både höger och vänster sida) till spetsen av maskens nose och tail , respektive (figur 1)5,6,8. EG sträcker sig från cirka 1 µm 2 x 1000 µm, vilket gör den till den största cellen i djuret. På en subcellulär nivå är utsöndringar kanalen en enkel tub, genereras från en basal membran riktad mot pseudocoelom och tunnel av ett lumenal membran (endotube). Canal lumenal membranet ansluts till kanal lumenal membranet på dess endast intercellulära korsning; kanalerna är annars junctionless längs deras längder (figur 1). Utsöndringsorganen canal lumenal membranet och dess submembraneous cytoskelettet är apikala, definieras av sin molekylära sammansättning som liknar sammansättningen av det apikala membranet och submembraneous cytoskelettet av flercelliga rör, till exempel tarmen, och andra (t.ex., platt) epitel. Cytoplasmiska organeller, inklusive endosomal vesikulär och andra (t.ex., Golgi) endomembranes är fördelade längs kanalen. Dessutom är flera canaliculära blåsor – antingen ansluten till det lumenal membranet, och/eller sammankopplade eller isolerade – gängade genom kanalen cytoplasman7,8,9,10 . Denna dynamiska plasma-membran/canaliculära anslutning ytterligare utökar kanalens membran system och bidrar till både lumen morfogenes och osmoregulation10. Utsöndringsorganen kanalen består således nästan helt av endo- och plasma membran, som ger en utmärkt modell för analys av polariserade membran biogenes och regleringen av de endo-till plasmamembranet gränssnitt. Den dramatiska expansionen av det apikala membranet under kanalen morfogenes – i detta encelliga system sammanfaller med lumen förlängning – kan också analysera de arkitektoniska problem som uppstår av behovet av att stabilisera och centrera en intracellulär lumenal membran . Detta protokoll fokuserar på analys av kanalen röret och lumen’s strukturella morfogenes och intracellulära membran dynamiken krävs för denna process snarare än på de signaler som direkt cell rörelser som genererar EG: s ställning i den utsöndringar systemet och konstruera dess intrikata anslutningar till andra cellulära element (ses i6).

En ytterligare fördel med C. elegans encelliga kanalsystemet för analys av polariserade membran och intracellulära lumen biogenes är dess förmåga att avskilja, genom utvecklande tiden, generering av olika komponenter av dess membran och korsningar. EG är född på ventrala stängning och kvittar ventro-sido i svalget under mitten av embryogenes5,6,8, under vilken gången laterala canal förlängning och förgrening uppstå. Detta följs av främre-bakre kanalen förlängning under sena embryogenes, en process som fortsätter in på L1-larvstadium (figur 1). I en nykläckt larv, bakre kanalen spetsen når cirka mitten av masken, fullt förlänga till svansen slutet av L1 scenen, varefter kanalen förlänger tillsammans med den mask8. Aktiva kanalen tillväxt med en hastighet som överstiger djurets tillväxt således slutar vid den första larvstadium, men ytterligare tillväxt sker parallellt med tillväxten av hela djuret under ytterligare larval arrangerar (L2 – 4). Denna inställning ger möjlighet att analysera olika steg i de novo polariserade membran biogenes oberoende av polariserade celldelning eller migration. Dessutom tillåter det avskiljandet av denna process från montering av vägkorsningar (som förekommer i embryot innan lumen). deras exakta krav i membran polarisering är fortfarande en öppen fråga i fältet polaritet. Slutligen, den separerar unikt apikala från basal membran expansion, den senare processen som föregick tidigare i utsöndringsorganen kanaler10. C. elegans utsöndringsorganen canal modellen är därför ett särskilt informativt komplement på intestinal modell som delar ett antal dessa fördelar för analys av polariserade membran biogenes men körs det i en multicellulär inställning (se det medföljande papperet på intestinal tubulogenesis3).

Även om vildtyps-kanalerna är ultratunna tubuli i denna lilla mask, kan deras lumen vara visualized direkt av Nomarski optik i denna genomskinliga djur. I själva verket kan mutant cystisk kanalen morfologier karakteriseras i omärkta djur med låg förstoring dissekera mikroskopi, som har använts med stor framgång i framåt genetiska skärmar för att identifiera gener som är involverade i tubulogenesis11. Förbättrad visualisering av morfologi av kanaler och åtskillnad av membranen polariserade, cytoskeletal komponenter, olika intracellulära organeller och andra subcellulära strukturer, dock kräver märkning och högre makt lysrör dissekera och confocal microscopy. Även om kanalerna finstruktur utgör ett antal svårigheter för märkning och mikroskopi, membran och subcellulära komponenter kan särskiljas via de specifika molekylerna som är unika för varje fack, och djur kan monteras säkert för mikroskopi om vissa försiktighetsåtgärder vidtas för att undvika att införa artefakter (se protokollet och diskussion). Märkning kan göras av immunhistokemi i fasta prover, eller genom att generera transgena maskar uttrycker fluorescerande fusionsproteinerna under sin egen kontroll eller utsöndringar canal-specifika initiativtagare för i vivo imaging. Det här protokollet beskriver den sistnämnda märkning tekniken (se det medföljande papperet på intestinal tubulogenesis för färgning3-antikropp).

Möjligheten att kombinera i vivo förlust – eller gain-of-function studier med i vivo imaging analys på den enda cellen nivå under hela utvecklingen gör kanalen C. elegans utsöndringsorganen en särskilt stark modell för molekylära och cellulära analys av encelliga tubulogenesis. Framåt eller bakåt genetiska skärmar kan utföras med en vildtyp eller märkt transgena djur att identifiera canal morfogenes fenotyper (exempelvis cystor) och deras underliggande gen brister. Alternativt kan sådana skärmar starta med en mutant fenotyp (t.ex., en cystisk kanal) och identifiera dämpning eller förstärkare av denna fenotyp för att identifiera gener som funktionellt samverkar med den gen som orsakar den mutanta fenotypen. Den genetiska defekten orsakar den mutanta fenotypen kan inducera en förlust (t.ex., via gen radering) eller en vinst (t.ex. via en aktiverande mutation eller via införandet av överskjutande gen kopior) av den undersökta funktionen. Vidarebefordra mutagenes eller systematisk RNAi skärmar är utan förutfattade meningar på geners funktion och en opartisk bedömning av genernas funktion av intresse. Med tanke på tillgången av genome-wide RNAi utfodring bibliotek, kan nästan varje gen enkelt rivas av RNAi i C. elegans, sådan att någon enda gen av intresse eller någon grupp av gener (t.ex., i riktade skärmar) kan också vara snabbt utforskad för sin effekt i en omvänd genetik strategi. För att visa en möjlig kombination av metoder, vi här beskriver en riktade RNAi interaktion skärm, börjar med en gain-of-function cystisk utsöndringsorganen canal mutant, märkt med cytoplasmiska canal grönt fluorescerande protein (GFP). Den mutanta fenotypen genererades av överuttryck av erm-1, en mycket C. elegans ortholog membran-aktin linker familjen Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), som har varit inblandade i lumen morfogenes och membran organisation i många arter12. C. elegans ERM-1 lokaliserar till lumenal membran av inre organ, till exempel utsöndringar kanalen och tarmen, och krävs för lumen bildas i båda13. ERM-1 överuttryck rekryterar överskott aktin och blåsor till canal lumenal membranet, öka flux in i lumen och generera en kort cystisk kanal och en krusad lumenal membran med förtjockad aktin underull9. Protokollet beskrivs hur du skapar transgena stammar med utsöndringar-canal-uttryckta märkt fusion proteiner (eller andra proteiner); hur du utför riktade RNAi skärmar börjar med sådana stammar, att identifiera modifierare av en canal fenotyp; och hur man visuellt analysera resultaten av sådana skärmar genom att dissekera och confocal fluorescensmikroskopi, inklusive enkla sätt att kvantifiera informativ tubulogenesis fenotyper. Alternativ märkning tekniker och detaljer av RNAi, anpassas till de ofta dödliga tubulogenesis generna, kan hittas i det medföljande papperet på intestinal tubulogenesis3. Alla metoder kan användas i olika kombinationer för utredning av andra frågor på kanalen tubulogenesis.

Protocol

1. märkning C. elegans Excretory kanalen av fluorescerande fusionsproteinerna 14 Obs: se det medföljande papperet på intestinal tubulogenesis 3 för märkning av i situ antikropp färgning förfaranden anpassas till kanalen utsöndringar. Se tabell 1 för exempel på molekyler som visat sig användbar för att visualisera C. elegans utsöndringsorganen canal endo- och plasma membran, tabel…

Representative Results

Det här protokollet beskriver hur du använder C. elegans utsöndringsorganen kanaler att visuellt och molekylärt analysera encelliga tubulogenesis och intracellulära lumen morfogenes i en enda cell. Under deras utvidgning från och med mitten av embryogenes till vuxen ålder fortsätter fyra utsöndringsorganen kanaler att expandera sin basolateral och apikala/lumenal membran tillsammans med deras canaliculära och endosomal endomembrane-system, vilket ger en unik modell för…

Discussion

C. elegans’ genetisk mångsidighet, öppenhet, enkel kropp plan och invarianta cell härstamning alla gör det till en utmärkt modell för analys av morfogenes. Det här protokollet beskriver hur man kombinerar standard genetiska manipulationer och imaging studier för att dra nytta av de 2 micron tunn C. elegans utsöndringsorganen kanaler för att studera polariserade membran och intracellulära lumen biogenes i en enda cell tub.

Märkning
C. elegan…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar M. Buechner (University of Kansas, Kansas, USA), K. Nehrke (University of Rochester Medical Center, Rochester, New York, USA) och stadens Caenorhabditis genetik, finansierad av National Institutes of Health, Office av infrastruktur för forskning Program (P40 OD010440). Detta arbete stöds av bidrag NIH GM078653, MGH är 224570 och SAA 223809 till V.G.

Materials

Cloning
Plasmid pPD95.75 Addgene Cat. No. 37464
PCR Kit Qiagen Cat. No. 27106
Ligation kit New England Biolabs Cat. No. E2611L
DNA marker Thermo Scientific Cat. No. SM1331
Agarose DNA grade Fisher Scientific Cat. No. BP164-100
Competent cells New England Biolabs Cat. No. C2987H
Tris Fisher Scientific Cat. No. BP154-1
EDTA Sigma Cat. No. ED-1KG
Acetic acid Fisher Scientific Cat. No. A38S-500
Ethidium bromide Fisher Scientific Cat. No. BP1302-10
Equipments
PCR machine  MJ Research Cat. No. PTG-200 
Centrifuge Eppendorf  Cat. No. 5415C
Water Bath Precision Scientific  Cat. No. 666A3 
Gel running instrument Fisher Scientific Cat. No. 09-528-165
Gel running power supply Fisher Scientific Cat. No. 45-000-465
Molecular Imager Gel Doc XR System Bio-Rad Cat. No. 1708195EDU
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific Cat. No. ND1000
C. elegans related1 1see reference27 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates2 2see reference24 for protocols.
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Yeast Extract BD Biosciences Cat. no. 212750
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
Ampicillin Sigma Cat. no. A0116
Tetracycline Fisher Scientific Cat. no. BP912
M9 Medium2 2see reference24 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
Na2HPO4 Sigma Cat. no. S7907
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
NGM plates 2 2see reference24 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Peptone  BD Biosciences Cat. no. 211677
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
CaCl2 Sigma Cat. no. C3881
Cholesterol  Sigma Cat. no. C8667
K2HPO4  Sigma Cat. no. P3786
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
RNAi plates3 3see reference60 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Peptone  BD Biosciences Cat. no. 211677
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
CaCl2 Sigma Cat. no. C3881
Cholesterol  Sigma Cat. no. C8667
K2HPO4  Sigma Cat. no. P3786
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
IPTG  US Biological Cat. no. I8500
Carbenicillin Fisher Scientific Cat. no. BP2648
NaOH Fisher Scientific Cat. no. SS266-1
Sodium hypochlorite Fisher Scientific Cat. no. 50371500
Bacteria
OP50 bacteria CGC
HT115 bacteria CGC
Genome-wide RNAi libraries
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref29,49) Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref50) Source BioScience
Imaging related
Lidocaine MP Biomedicals,LLG Cat. no. 193917
Materials
Vacuum Grease Silicone Beckman Cat. no. 335148
Microscope slides  Fisher Scientific Cat. no. 4448
Microscope coverslips (22×22-1） Fisher Scientific Cat. no. 12-542-B
Tissue culture plate, 6 well  Corning Inc. Cat. no. 08-772-33
Equipment
SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Lubarsky, B., Krasnow, M. A. Tube morphogenesis: making and shaping biological tubes. Cell. 112 (1), (2003).
  2. Sundaram, M. V., Cohen, J. D. Time to make the doughnuts: Building and shaping seamless tubes. Semin. Cell Dev. Biol. S1084-9521, 30130-30136 (2016).
  3. Zhang, N. The C. elegans intestine as a model for intercellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis at the single-cell level. JoVE. , (2017).
  4. Andrew, D. J., Ewald, A. J. Morphogenesis of epithelial tubes: Insights into tube formation, elongation, and elongation. Dev. Biol. 341 (1), 34-55 (2010).
  5. Nelson, F. K., Albert, P. S., Riddle, D. L. Fine structure of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system. J. Ultrastruct. Res. 82 (2), 156-171 (1983).
  6. Sundaram, M. V., Buechner, M. The Caenorhabditis elegans Excretory System: A Model for Tubulogenesis, Cell Fate Specification, and Plasticity. Genetica. 203 (1), 35 (2016).
  7. Altun, Z. F., Hall, D. H. Excretory system. WormAtlas. , (2009).
  8. Buechner, M. Tubes and the single C. elegans excretory cell. Trends Cell Biol. 12 (10), 479-484 (2002).
  9. Khan, L. A. Intracellular lumen extension requires ERM-1-dependent apical membrane expansion and AQP-8-mediated flux. Nat. Cell Biol. 15 (2), 143-156 (2013).
  10. Kolotuev, I., Hyenne, V., Schwab, Y., Rodriguez, D., Labouesse, M. A pathway for unicellular tube extension depending on the lymphatic vessel determinant Prox1 and on osmoregulation. Nat. Cell Biol. 15 (2), 157-168 (2013).
  11. Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Dev. Biol. 214 (1), 227-241 (1999).
  12. Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).
  13. Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1. Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).
  14. Sambrook, J., Sambrook, J., DW, R. u. s. s. e. l. l. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2006).
  15. Fire, A., Harrison, S. W., Dixon, D. A modular set of lacZ fusion vectors for studying gene expression in Caenorhabditis elegans. Gene. 93 (2), 189-198 (1990).
  16. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  17. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  18. Pawley, J. B. . Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).
  19. Hibbs, A. R. . Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).
  20. Bankhead, P. . Analyzing fluorescence microscopy images with ImageJ. , (2014).
  21. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetica. 157 (3), 1217-1226 (2001).
  22. Frøkjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  23. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  24. Barrangou, R. Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution. Science. 344 (6185), 707-708 (2014).
  25. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetica. 202 (3), 885-901 (2016).
  26. Esposito, D., Garvey, L. A., Chakiath, C. S. Gateway cloning for protein expression. Methods Mol. Biol. 498, 31-54 (2009).
  27. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  28. Hobert, O. PCR fusion-based approach to create reporter gene constructs for expression analysis in transgenic C. elegans. Biotechniques. 32 (4), 728-730 (2002).
  29. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat. Rev. Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
  30. Berry, K. L., Bulow, H. E., Hall, D. H., Hobert, O. A. C. elegans CLIC-like protein required for intracellular tube formation and maintenance. Science. 302 (5653), 2134-2137 (2003).
  31. Mattingly, B. C., Buechner, M. The FGD homologue EXC-5 regulates apical trafficking in C. elegans tubules. Dev. Biol. 359 (1), 59-72 (2011).
  32. Shaye, D. D., Greenwald, I. The disease-associated formin INF2/EXC-6 organizes lumen and cell outgrowth during tubulogenesis by regulating F-actin and microtubule cytoskeletons. Dev. Cell. 32 (6), 743-755 (2015).
  33. Lant, B. CCM-3/STRIPAK promotes seamless tube extension through endocytic recycling. Nat. Commun. 6 (6), 6449 (2015).
  34. Paupard, M. C., Miller, A., Grant, B., Hirsh, D., Hall, D. H. Immuno-EM localization of GFP-tagged yolk proteins in C. elegans using microwave fixation. J. Histochem. Cytochem. 49 (8), 949-956 (2001).
  35. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
  36. Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
  37. Sherman, T. The abts and sulp families of anion transporters from Caenorhabditis elegans. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 289 (2), C341-C351 (2005).
  38. . Transgeneome website Available from: https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html (2017)
  39. . National BioResource Project (NBRP)::C. elegans Available from: https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/ (2017)
  40. Heppert, J. K. Comparative assessment of fluorescent proteins for in vivo imaging in an animal model system. Mol. Biol. Cell. 27 (22), 3385-3394 (2016).
  41. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  42. . BLAST Available from: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2017)
  43. Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002 (2001).
  44. Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  45. Rual, J. F. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome research. 14 (10B), 2162-2168 (2004).

Tags

C. ElegansExcretory CanalIntracellular LumenPolarized Membrane BiogenesisTubulogenesisPolarityGFP FusionRNAiLive ImagingMembrane MarkersOrganelle MarkersPromotersERM-1Cystic Canal PhenotypeModifier Screen
check_url/it/56101?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging. J. Vis. Exp. (128), e56101, doi:10.3791/56101 (2017).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image